Kapas, minor set surgeon, papan potong, zipline plastic bag, dan ether untuk anastesi
b. Tahap Fiksasi
Formalin-PBS 10
c. Tahap Dehidrasi
Gelas ukur 1000 ml, 500 ml, beaker Glass 1000 ml, 500 ml, corong kaca, aquadest, alkohol absolut CH
3
CH
2
OH Mallinckrodt Chemicals, alkohol 95, dan toluol.
d. Tahap Clearing
Larutan toluol:alkohol 1:1
e. Tahap Embedding
Hotplate stirer sRS 710 HA, vials stopper tools neck, dan Paraplast Leica Microsystem
f. Tahap Blocking
Cetakan blocking
g. Tahap Pemotongan
Object glass, bunsen, mikrotom geser, korek api gas, waterbath, kulkas, beaker glass 200 ml, putih telur, gliserin, dan es batu.
h. Tahap Pewarnaan
Cover glass, staining jar, mikroskop shimadzu T025A, spatula kaca, timer, xylol, hematoksilin, eosin, balsam Canada, dan H
2
SO
4.
i. Tahap Foto Jaringan
Kotak preparat, kamera preparat, komputer lab, DVD foto, mikroskop Olympus BX41
j. Untuk semua tahap histoteknik
Tissue dan tissue berpori
3.4.2. Adaptasi Hewan Coba
Setelah hewan tiba di laboratorium animal house, hewan coba diadaptasikan selama 14 hari dengan diberi makan dan minum ad libitum.
Bedding dan kandang diganti dengan yang baru setiap 3 hari.
24
3.4.3. Tahap Induksi STZ
Pada hari ke-15, tikus dipuasakan selama 10 jam sebelum diinduksi STZ 60 mgkgBB secara intraperitoneal. Kemudian dilakukan pengukuran kadar
glukosa darah pada hari ke-5 setelah penginduksian STZ hari ke-21. Tikus yang digunakan pada percobaan ini adalah yang memiliki kadar glukosa darah 200
mgdL.
24
3.4.4. Tahap Nekropsi
Siapkan alat dan bahan yang diperlukan. Kemudian ambil plastik yang sudah ditulis nama atau kode tikus dan organ. Tuangkan formalin-PBS 10 ke
dalam plastik sekitar 20x volume jaringan sampel. Tikus dianastesi dengan cara dimasukkan ke dalam toples berisi kapas yang diberikan eter. Tunggu hingga
tikus hilang kesadaran dengan cara memberikan rangsang nyeri pada telapak kaki tikus, bila tidak memberi respon maka efek anastesi sudah bekerja. Proses
pembedahan dilakukan pada bagian abdominothoracal dan dilakukan nekropsi pada organ ginjal. Organ dipotong dengan ketebalan 3-5 mm dan dimasukan ke
dalam plastik yang berisi formalin-PBS 10.
25
3.4.5. Tahap Pemrosesan Jaringan
3.4.5.1. Dehidrasi
Proses dehidrasi menggunakan alkohol dengan variasi konsentrasi 50, 70, 80, 90. Pengenceran alkohol dilakukan dengan cara penghitungan
sebagai berikut: 1.
Pengenceran alkohol 50 = alkohol 95 500 ml + aquades 450 ml 2.
Pengenceran alkohol 70 = alkohol 95 700 ml + aquades 250 ml 3.
Pengenceran alkohol 80 = akohol 95 800 ml + aquades 150 ml 4.
Pengenceran alkohol 90 = alkohol 95 900 ml + aquades 50 ml
Setiap konsentrasi larutan alkohol tersebut ditempatkan pada 3 buah pot plastik masing-masing 23 pot plastik. Setiap pot dengan konsentrasi alkohol yang sama
diberi label I, II, III untuk menandakan urutan proses dehidrasi. Tahap dehidrasi dimulai dengan memasukkan potongan
ke dalam pot plastik berlabel I, II, lalu III. Potongan organ direndam selama 15 menit secara
berurutan ke dalam larutan alkohol 50, 70, 80, 90 dan 95.
26
3.4.5.2. Clearing
Tahapan Clearing bertujuan untuk mengeluarkan alkohol dari jaringan, karena alkohol dan paraffin tidak dapat menyatu, sehingga larutan yang akan
dimasukkan ke dalam jaringan dapat berikatan dengan paraffin. Pada tahapan ini digunakan larutan toluol:alkohol 1:1 dan toluol murni.
21
Pertama, potongan organ dimasukan ke dalam larutan toluol:alkohol 1:1 dan direndam selama 25 menit. Kemudian potongan organ tersebut dipindahkan
dan direndam ke dalam toluol murni selama 60 menit hingga menjadi bening. Perendaman dalam toluol murni diperpanjang sampai potongan menjadi bening.
Waktu perendaman dalam toluol murni paling lama selama 120 menit, karena akan menyebabkan pengerasan pada jaringan sehingga sulit untuk dilakukan
pemotongan.
26
3.4.5.3. Embedding
Tahap embedding bertujuan untuk mengeluarkan cairan pada saat proses clearing dan menggantinya dengan paraffin karena cairan saat proses clearing
dapat mengkristal di dalam jaringan dan menyebabkan jaringan mudah robek saat tahap pemotongan.
26
Pertama, buat larutan toluol:paraffin 50 ml:50 ml. Kemudian bungkus organ menggunakan tisu berpori lalu rendam dalam larutan tersebut dan diamkan
pada suhu ruangan selama 24 jam. Setelah itu cairkan paraffin dengan suhu diantara 56-62
o
C dan diberi label I, II, III dan IV. Masukkan potongan organ ke dalam larutan paraffin secara berurutan, masing-masingnya selama 15 menit.
26