Burchard, jika timbul warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi biru ungu atau biru hijau menunjukkan adanya steroidatriterpenoida Harborne, 1987.
3.6.6 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia sebanyak 3 g disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air suling 7:3 dan 10 ml larutan asam sulfat 2 N. Direfluks selama 1 jam,
didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, lalu didiamkan selama 5 menit dan
disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3 dilakukan berulang-ulang sebanyak 3 kali. Kumpulan sari air diuapkan pada
temperatur tidak lebih dari 50
o
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa dimasukkan dalam tabung reaksi, selanjutnya diuapkan di atas penangas air.
Sisa dilarutkan dalam 2 ml air suling dan 5 tetes pereaksi Molish, kemudian secara perlahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Glikosida
positif jika terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan Depkes RI, 1995. Tabel hasil skrining fitokimia dapat dilihat pada lampiran 8 halaman 55.
3.7 Pembuatan ekstrak
Serbuk simplisia sebanyak 300 g dimasukkan ke dalam bejana tertutup dan dibasahi dengan cairan penyari etanol 96 sampai semua simplisia terendam,
dibiarkan selama 3 jam. Massa dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator, kemudian dituangi cairan penyari secukupnya sampai semua simplisia
terendam dan terdapat selapis cairan penyari di atasnya, perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam. Kran perkolator dibuka dan
dibiarkan tetesan ekstrak mengalir dengan kecepatan 1 ml tiap menit, ditambahkan berulang-ulang cairan penyari secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan
penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan setelah tetesan perkolat terakhir tidak bereaksi lagi dengan pereaksi untuk uji senyawa golongan flavonoida.
Perkolat yang diperoleh diuapkan menggunakan rotary evaporator pada temperatur ±40
o
C, tekanan 2 atm, kemudian dipekatkan menggunakan freeze dryer pada suhu -40
o
C selama ±24 jam sehingga diperoleh ekstrak etanol Depkes, 1986. Bagan pembuatan ekstrak dapat dilihat pada lampiran 9 halaman 56.
3.8 Ekstraksi cair-cair senyawa flavonoida
Ekstraksi cair-cair senyawa flavonoida dari ekstrak etanol dilakukan berturut-turut dengan pelarut n-heksan, kloroform dan etilasetat.
Cara kerja: Ekstrak etanol ditambah 20 ml etanol, lalu dilarutkan dalam air panas
sebanyak 100 ml, dihidrolisis dengan asam ditambah asam klorida 2 N, direfluks selama 5 jam, kemudian disaring dan didinginkan, lalu dimasukkan ke dalam
corong pisah, mula-mula difraksinasi dengan n-heksan sebanyak 100 ml, dilakukan 3 kali, diperoleh fraksi n-heksan dan fraksi air. Fraksi n-heksan
dipisahkan, fraksi air kemudian difraksinasi lagi dengan kloroform sebanyak 100 ml, dilakukan 3 kali, diperoleh fraksi kloroform dan fraksi air, kemudian fraksi
kloroform dipisahkan, fraksi air difraksinasi lagi dengan 100 ml etilasetat, dilakukan 3 kali, diperoleh fraksi etilasetat dan fraksi air. Masing-masing fraksi
dipekatkan. Bagan ekstraksi cair-cair dari ekstrak etanol dapat dilihat pada lampiran 10
halaman 57. Bagan isolasi senyawa flavonoida dari ekstrak etanol dapat dilihat pada lampiran
11 halaman 58.
3.9 Analisis senyawa flavonoida dari ekstrak etanol dan hasil fraksinasi
