METODE PENELITIAN rhamnosus R21 dan S. Typhimurium

III. METODOLOGI PENELITIAN

A. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei sampai November 2012. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium General Microbiology, Fermentation Microbiology South East Asia for Food and Agricultural Science and Technology SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor.

B. BAHAN DAN ALAT

Kultur yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat BAL asal ASI koleksi SEAFAST Center IPB, yaitu Lactobacillus rhamnosus R21. Isolat tersebut memiliki ketahanan terhadap suhu tinggi dan memiliki kemampuan menghambat E. coli enteropatogenik K.1.1 EPEC K.1.1 Hartanti 2007. Isolat ini juga mampu menghambat pertumbuhan Cronobacter sakazakii YRC3a selama rekonstitusi susu formula bayi Saputra 2012. Kultur Salmonella yang digunakan adalah Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 atau lebih sering disebut Salmonella Typhimurium. Bahan uji yang digunakan adalah susu formula sufor komersial untuk bayi usia 0-6 bulan dengan komposisi nutrisi: karbohidrat 59 g100 g, protein 9.8 g100 g, lemak 24 g100 g, dan nutrisi lainnya berdasarkan informasi nilai gizi yang tercantum di kemasan produk. Bahan lain yang digunakan meliputi air minum steril, larutan fisiologis NaCl 0.85 steril, akuades steril, serta buffer pH 4 dan pH 7. Media yang digunakan, yaitu de Man Rogosa Sharp Broth MRSB OXOID CM0359, de Man Rogosa Sharp Agar MRSA OXOID CM0361 dan MERCK 1.10660.0500, MRSA-Acetic Acid MRSA-AA Fitriyah 2010, Nutrient Broth NB OXOID CM0001, Nutrient Agar NA MERCK 1.05450.0500, Bismuth Sulfite Agar BSA Difco 273300 dan MERCK 1.05418.0500, dan Xylose Lysine Deoxycholate Agar XLDA Difco 278850. Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah pipet mikro Finnpipette berikut tip, vortex Vortex-Genie 2, Sentrifuse Sorvall, inkubator Incucell MMM-Group, termometer 100 o C, hot plate Steroglass, pH Meter Eutech pH meter 700, Autoklaf ALP Model-40, laminar flow Labconco purifier class II biosafety cabinet-delta series, botol susu 25 mL, dan alat analisis mikrobiologi standar lainnya.

C. METODE PENELITIAN

Penelitian ini didahului dengan tahap persiapan, yaitu menyediakan stok kultur Lactobacillus rhamnosus R21 dan Salmonella Typhimurium. Stok kultur tersebut disimpan pada suhu rendah dan selanjutnya digunakan untuk membuat kultur kerja saat akan melakukan eksperimen. Setelah persiapan selesai, dilakukan penelitian yang terdiri dari tiga tahap, yaitu pemilihan media selektif untuk kedua bakteri, uji kompetisi, dan evaluasi kemampuan L.rhamnosus R21 setelah rekonstitusi untuk menurunkan pH. Tahapan penelitian secara umum dapat dilihat pada Gambar 7. 17 TAHAP PERSIAPAN TAHAP PENELITIAN Gambar 7. Tahapan penelitian secara umum Persiapan kultur bakteri:  Kultur stok L. rhamnosus R21  Kultur stok S. Typhimurium Pemilihan Media Selektif:  Media selektif untuk L. rhamnosus R21  Media selektif untuk S. Typhimurium Metode Analisis:  Pewarnaan gram  Uji produksi CO 2 dari fermentasi glukosa oleh L. rhamnosus R21 Uji Kompetisi L. rhamnosus R21 dengan S. Typhimurium:  Kompetisi dengan jumlah awal BAL 10 9 CFUmL pada suhu rekonstitusi 27, 60, dan 70 o C  Kompetisi dengan jumlah awal BAL 10 8 CFUmL pada suhu rekonstitusi 70 o C  Kompetisi dengan jumlah awal BAL 10 6 CFUmL pada suhu rekonstitusi 70 o C Evaluasi kemampuan L. rhamnosus R21 setelah rekonstitusi untuk menurunkan pH:  Susu dengan jumlah awal BAL 10 9 CFUmL pada suhu rekonstitusi 27, 60, dan 70 o C  Susu dengan jumlah awal BAL 10 8 CFUmL pada suhu rekonstitusi 27, 60, dan 70 o C  Susu dengan jumlah awal BAL 10 6 CFUmL pada suhu rekonstitusi 27, 60, dan 70 o C Metode Analisis:  Total BAL selama hang time jam ke-0, 2, 4, 6, dan 8  Total S. Typhimurium selama hang time jam ke-0, 2, 4, 6, dan 8  Pengukuran pH selama hang time jam ke-0, 2, 4, 6, dan 8 Metode Analisis:  Pengukuran pH pada jam ke- 0 dan jam ke- 8 18 TAHAP PERSIAPAN Persiapan kultur bakteri

L. rhamnosus R21 dan S. Typhimurium

Pada tahap ini terlebih dahulu dilakukan konfirmasi morfologi sel L. rhamnosus R21 dan Salmonella Typhimurium dengan pewarnaan gram. Untuk L. rhamnosus R21 dilanjutkan dengan uji kemampuan untuk menghasilkan CO 2 dari proses fermentasi glukosa dengan menggunakan media agar semi solid Gibson Harrigan 1976. Uji tersebut untuk mengetahui tipe fermentasi dari Lactobacillus rhamnosus R21 yang digunakan. Sebelumnya telah diketahui bahwa L. rhamnosus R21 adalah bakteri gram positif, berbentuk batang panjang, dan merupakan BAL homofermentatif Hartanti 2007. Sedangkan Salmonella Typhimurium adalah bakteri gram negatif dengan bentuk sel batang pendek 0.7-1.5 x 2.0-5.0 µm Bell dan Kyriakides 2002. Prosedur pewarnaan gram dan uji produksi CO 2 oleh L. rhamnosus R21 dapat dilihat pada Gambar 8 dan 9. Prosedur selanjutnya, yaitu persiapan kultur bakteri L. rhamnosus R21 dan S. Typhimurium. Kultur L. rhamnosus R21 yang digunakan dalam penelitian ini berupa kultur kering beku yang disimpan pada suhu rendah. Oleh karena itu, kultur harus disegarkan terlebih dahulu sebelum digunakan. Untuk menyegarkan L. rhamnosus R21, sebanyak satu ose kultur dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 10 mL MRSB steril kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Dari kultur tersebut, dibuat kultur stok L. rhamnosus R21 dengan menginokulasikan beberapa ose ke dalam sejumlah tabung berisi agar semi solid MRSA lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Media MRSA semi solid ini dibuat dengan mencampurkan 50 dosis MRSA dan 50 dosis MRSB. Kultur stok dibuat dalam beberapa tabung sesuai dengan kebutuhan. Dengan cara tersebut, diperoleh kultur stok L. rhamnosus R21. Kultur stok disimpan di suhu rendah selama tidak digunakan. Kultur yang digunakan untuk analisis disebut kultur kerja. Kultur ini disiapkan dengan mengambil beberapa ose kultur L. rhamnosus R21 dari kultur stok dan menginokulasikannya ke dalam 10 mL MRSB steril. Setelah inkubasi pada 37 o C selama 24 jam, kultur kerja siap digunakan. Prosedur persiapan kultur L.rhamnosus R21 dapat dilihat pada Gambar 10. Kultur S. Typhimurium yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari sediaan kultur Salmonella Typhimurium dalam agar miring TSIA. Proses penyiapan kultur induk, kultur stok, dan kultur kerja S. Typhimurium sama dengan proses penyiapan kultur L. rhamnosus R21 hanya saja media yang digunakan berbeda. Media yang digunakan untuk membuat kultur induk S. Typhimurium adalah 10 mL NB steril. Kultur stok S. Typhimurium disimpan dalam media NA miring pada suhu rendah. Sedangkan kultur kerja S. Typhimurium dibuat dengan media NB steril sebanyak 10 mL. Prosedur persiapan kultur S. Typhimurium dapat dilihat pada Gambar 11. 19 Gambar 8. Prosedur pewarnaan gram Fiksasi panas Penambahan kristal violet selama 1 menit Preparat bakteri Cuci dengan air Penambahan lugol selama 1 menit Cuci dengan air Cuci dengan alkohol Cuci dengan air Penambahan safranin selama 20 detik Dibiarkan kering Cuci dengan air Penambahan cairan imersi Pengamatan dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 1000x 20 Gambar 9. Prosedur uji produksi CO 2 oleh L. rhamnosus R21 dari fermentasi glukosa diadaptasi dari Hartanti 2007 dan Harrigan 1976 Ekstrak yeast 0.25 g D. glukosa 5 g MnSO 4 0.04 g + 10 mL aquades Diambil 1 mL Susu skim 9.6 g + 80 mL aquades Campur merata Sterilisasi 121 o C selama 15 menit NA 0.56 g + 20 mL aquades Sterilisasi 121 o C selama 15 menit NA steril 20 mL Pendinginan di suhu ruang Inokulasi beberapa ose kultur L. rhamnosus R21 Penuangan NA ke permukaan agar Gibson Agar Gibson semi solid Inkubasi 37 o C selama 24 jam Pengamatan: Agar tetap kompak homofermentatif Agar pecah heterofermentatif 21 kultur kering beku L. rhamnosus R21 ↓ inokulasi ke dalam 10 mL MRSB steril ↓ inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam ↓ inokulasi ke dalam 5 tabung berisi 5 mL MRSA semi solid ↓ inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam ↓ kultur stok disimpan di lemari pendingin inokulasi ke dalam 10 mL MRSB steril ↓ inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam ↓ kultur kerja Gambar 10. Prosedur persiapan kultur L.rhamnosus R21 Sediaan kultur S. Typhimurium dalam agar miring TSIA ↓ inokulasi ke dalam 10 mL NB steril ↓ Inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam ↓ inokulasi ke dalam 3 tabung agar miring NA steril ↓ Inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam ↓ kultur stok Disimpan di lemari pendingin inokulasi ke dalam 10 mL NB steril ↓ Inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam ↓ Kultur kerja Gambar 11. Prosedur persiapan kultur S. Typhimurium 22 TAHAP PENELITIAN 1. Pemilihan media selektif untuk membedakan L. rhamnosus R21 dan Salmonella Typhimurium Media pertumbuhan yang selektif terhadap L. rhamnosus R21 dan S. Typhimurium diperlukan terutama agar pertumbuhan kedua bakteri pada kompetisi dapat dianalisis dengan mudah, dimana dalam satu cawan hanya salah satu dari kedua bakteri yang tumbuh. D ari kultur kerja L. rhamnosus R21 dan S. Typhimurium masing-masing dibuat seri pengenceran dari 10 -1 sampai 10 -7 . Sebanyak 1 mL kultur dari pengenceran 10 -6 dan 10 -7 dipupuk ke dalam 5 cawan petri steril lalu dituang 5 jenis media: MRSA, MRSA-AA, NA, BSA, atau XLDA. MRSA-AA merupakan MRSA yang ditambah asam asetat glasial 96 dengan konsentrasi 1.3 mLL MRSA Fitriyah 2010. Setelah media dituang, cawan digoyang secara perlahan dengan pola yang teratur membentuk angka 8 sehingga sampel dan media tercampur merata lalu dibiarkan hingga media memadat. Langkah ini dilakukan terhadap kedua kultur dan dilakukan duplo. Cawan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 s.d. 48 jam. Setelah itu pertumbuhan kedua bakteri di tiap media diamati. Media yang berhasil menumbuhkan Lactobacillus. rhamnosus R21 saja dipilih sebagai media selektif untuk L. rhamnosus R21. Sebaliknya, media dimana di dalamnya hanya tumbuh S. Typhimurium dipilih sebagai media selektif untuk S. Typhimurium. Sehingga diperoleh dua macam media untuk membedakan L. rhamnosus R21 dan S. Typhimurium. Kedua media ini akan digunakan pada tahap percobaan selanjutnya. Prosedur pemilihan media selektif disajikan pada Gambar 11. Gambar 12. Prosedur pemilihan media selektif untuk membedakan L. rhamnosus R21 dan S. Typhimurium Kultur kerja L. rhamnosus R21 Kultur kerja S. Typhimurium Pengenceran 10 -1 -10 -7 Pengenceran 10 -1 -10 -7 Pemupukan dari pengenceran 10 -6 dan 10 -7 ke dalam 5 cawan petri steril duplo Pemupukan dari pengenceran 10 -6 dan 10 -7 ke dalam 5 cawan petri steril duplo Penuangan 5 jenis media NA, MRSA, MRSA-AA, BSA, atau XLDA Penuangan 5 jenis media NA, MRSA, MRSA-AA, BSA, atau XLDA Inkubasi pada suhu 37 o C selama 24-48 jam Pemilihan 1 jenis media selektif L. rhamnosus R21 dan 1 jenis media selektif S. Typhimurium 23

2. Uji kompetisi L. rhamosus R21 dan S. Typhimurium pada susu formula yang

direkonstitusi Kultur kerja yang telah diinkubasi selama 24 jam mengandung sekitar 10 8 - 10 9 CFUmL sel bakteri. Untuk memastikan jumlah awal kedua bakteri sebelum rekonstitusi, dilakukan penghitungan L. rhamnosus R21 pada media MRSA-AA dan S. Typhimurium pada media BSA. Takaran susu formula disesuaikan dengan prosedur penyajian yang tertera pada kemasan, yaitu 3 sendok takar susu bubuk formula dalam 90 mL air 3 sendok takar = 13.2 g. Dalam penelitian ini, rekonstitusi susu formula dilakukan dengan menyeduh 3 g susu formula dengan 20 mL air minum steril Larasati 2012. Langkah pertama untuk memulai uji kompetisi adalah peyiapan biomassa basah L. rhamnosus R21. Kultur kerja L. rhamnosus R21 yang telah diinkubasi selama 24 jam disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 o C. Supernatan dibuang, sehingga diperoleh sel pelet L. rhamnosus R21. Selanjutnya, ke dalam sel pelet L. rhamnosus R21 ditambahkan 1-3 tetes larutan fisiologis NaCl 0.85 untuk mencegah sel L. rhamnosus R21 lisis. Selanjutnya sel pelet L. rhamnosus R21 diinokulasikan dengan pipet mikro ke dalam 3 g susu formula yang ditempatkan di dalam erlenmeyer, diaduk dengan batang pengaduk steril dan direkonstitusi dengan 20 mL air minum steril pada suhu rekonstitusi yang ditentukan. Setelah direkonstitusi, erlenmeyer yang berisi susu digoyang berputar agar inokulum BAL tersebar merata dan susu larut seluruhnya. Jumlah awal L. rhamnosus R21 yang digunakan ada 3 macam yaitu 10 9 , 10 8 , dan 10 6 CFUmL. Percobaan tiga jumlah awal BAL yang berbeda dilakukan untuk mengetahui jumlah BAL yang efektif menghambat S. Typhimurium di dalam susu formula rekonstitusi. Untuk mendapatkan jumlah awal BAL 10 9 CFUmL, kultur kerja L. rhamnosus R21 disentrifuse seluruhnya sebelum diinokulasikan ke dalam susu formula. Sedangkan, untuk memperoleh jumlah awal BAL 10 8 dan 10 6 CFUmL, kultur kerja L. rhamnosus R21diencerkan terlebih dahulu masing-masing 10x dan 100x sebelum disentrifuse. Sedangkan jumlah Salmonella Typhimurium yang digunakan sebanyak 10 4 CFUmL untuk semua perlakuan jumlah awal BAL. Jumlah ini diperoleh dengan mengencerkan kultur kerja S. Typhimurium 10 9 CFUmL sampai pengenceran 10 -5 kemudian dari pengenceran tersebut dipipet sebanyak 0.2 mL dan diinokulasikan ke 3 g susu formula. Jumlah Salmonella Typhimurium sebanyak 10 4 CFUmL menggambarkan dosis infeksi Salmonella pada manusia. Susu yang diinokulasi kultur L. rhamnosus R21 saja digunakan sebagai kontrol Lactobacillus rhamnosus R21, susu yang diinokulasi kultur S. Typhimurium saja digunakan sebagai kontrol S. Typhimurium, sedangkan susu yang diinokulasi kedua kultur bakteri digunakan untuk uji kompetisi. Kemudian ketiga kelompok susu tersebut direkonstitusi pada suhu yang ditetapkan. Suhu rekonstitusi yang digunakan terdiri dari suhu 27, 60, dan 70 o C. Suhu 27 o C merupakan suhu normal air pada kondisi suhu ruang. Suhu 60 o C digunakan untuk merepresentasikan suhu air yang umum digunakan oleh ibu-ibu di rumah sewaktu menyeduh susu formula. Suhu 70 o C merupakan suhu rekonstitusi yang dianjurkan oleh WHO FAO-WHO 2007 dan BPOM 2010. Analisis terhadap pertumbuhan L. rhamnosus R21, pertumbuhan S. Typhimurium, dan pH selama hang time 8 jam dilakukan pada tahap ini. Penghitungan total BAL, total S. Typhimurium, dan pengukuran pH dilakukan pada jam ke-0, 2, 4, 6, dan 8. Penghitungan total BAL dilakukan dengan metode tuang pada media MRSA-AA, sedangkan total S. Typhimurium dihitung pada media BSA. Analisis ini dilakukan sebanyak dua ulangan dan duplo. 24 Prosedur uji kompetisi dapat dilihat pada gambar di bawah ini: Gambar 13. Prosedur uji kompetisi L. rhamnosus R21 dengan S. Typhimurium

3. Evaluasi kemampuan L. rhamnosus R21 untuk menurunkan pH setelah

rekonstitusi Tahap ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh jumlah awal BAL dan suhu rekonstitusi terhadap penurunan pH susu setelah 8 jam hang time. Disiapkan susu formula dengan 9 macam Kultur kerja L. rhamnosus R21 Kultur kerja S. Typhimurium Pengenceran 10 o , 10 -1 , atau 10 -2 Pengenceran s.d 10 -5 Sentrifuse Biomassa basah L. rhamnosus R21 Penambahan 1-3 tetes larutan garam fisiologis Inokulasi ke dalam 3 g susu formula kontrol L. rhamnosus R21 Inokulasi ke dalam 3 g susu formula kompetisi Inokulasi ke dalam 3 g susu formula kontrol S. Ttyphimurium Pengadukan dengan batang pengaduk steril Rekonstitusi dengan air steril sebanyak 20 mL 27, 60, atau 70 o C Pemupukan pada jam ke- 0, 2, 4, 6, dan 8 pada media selektif untuk L. rhamnosus R21 dan media selektif untuk S. Typhimurium Pengukuran pH pada jam ke- 0, 2, 4, 6, dan 8 Inkubasi pada 37 o C selama 24-72 jam Total L. rhamnosus R21 dan S. TyphimuriumCFUmL 25 perlakuan yang berbeda, kombinasi dari 3 jumlah awal BAL 10 9 , 10 8 , dan 10 6 CFUmL dan 3 suhu rekonstitusi 27, 60, dan 90 o C. Masing-masing perlakuan diukur pH-nya sesaat setelah susu direkonstitusi jam ke-0 dan setelah hang time jam ke-8. Pengukuran pH ini dilakukan sebanyak dua kali ulangan dan duplo. Hasil yang diperoleh digunakan untuk mengetahui pengaruh jumlah awal L. rhamnosus R21 dan suhu rekonstitusi terhadap kemampuan BAL menghasilkan asam laktat dan menghambat S. Typhimurium.

D. METODE ANALISIS