III. BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli – Desember 2008. Pembuatan
preparat histologi dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian
Bogor IPB. Dokumentasi hasil histologi dilakukan di Laboratorium Histologi, Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan,
IPB. Disosiasi testis dan dokumentasinya dilaksanakan di Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar BBPBAT Sukabumi.
3.2 Prosedur Kerja
Tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah pengamatan preparat histologi yang bertujuan untuk mengetahui perkembangan morfologi sel testikular
dan disosiasi gonad yang berfungsi untuk menghitung komposisi sel testikular ikan gurame.
3.2.1 Pengumpulan dan Penanganan Ikan Gurame
Ikan gurame uji untuk sementara waktu dipelihara di akuarium atau bak tandon. Kemudian sebanyak 18 ekor ikan gurame dikelompokkan berdasarkan
tingkat perkembangan gonadnya, yaitu ikan yang belum berkembang gonadnya, ikan muda, ikan dewasa, dan ikan yang matang gonadnya. Jumlah ikan gurame
yang belum berkembang gonadnya sebanyak lima ekor. Kemudian secara berturut-turut jumlah ikan muda, ikan dewasa, dan ikan yang matang gonadnya
adalah 3, 3, dan 7 ekor. Berat tubuh ikan gurame yang digunakan berkisar antara 400
– 3200 g. Berat tubuh tersebut ditentukan dengan menggunakan timbangan manual dengan tingkat ketelitian 0,1 g. Ikan gurame diperoleh dari petani ikan di
Petir dan Empang Bogor, pasar swalayan di Bogor, dan BBPBAT Sukabumi.
3.2.2 Penentuan IKG
IKG diketahui dengan cara membandingkan antara berat gonad ikan dengan berat tubuhnya. Setiap ikan gurame dibedah kemudian diambil gonadnya.
Berat gonad ikan uji ditentukan dengan menggunakan timbangan digital dengan tingkat ketelitian 0,0001 g.
3.2.3 Pembuatan Preparat Histologi Testis
Setelah testis diambil dan ditimbang beratnya, testis dipotong menjadi dua bagian. Satu bagian digunakan untuk pembuatan preparat histologi testis dan
bagian lainnya untuk disosiasi testis. Sebelum diproses secara histologis, testis dibersihkan pada larutan Phosphate Buffer Saline
PBS. Testis difiksasi ke dalam larutan Bouin selama 48 jam. Kemudian
dilakukan dehidrasi dengan cara memasukkan testis ke dalam alkohol 70 selama 24 jam. Setelah itu, testis dipindahkan ke dalam alkohol 80, 90, dan 95 yang
masing – masing dilakukan selama 24 jam, sedangkan pada alkohol 100
absolut I, II, III, lama pemaparan masing – masing selama satu jam. Selanjutnya
dilakukan penjernihan dengan cara memindahkan testis dari alkohol absolut III ke larutan penjernih xylol. Pemaparan dilakukan dalam xylol I 30 menit, xylol II
30 menit, dan xylol III 1 jam. Tahap berikutnya yang dilakukan adalah infiltrasi dan embedding. Infiltrasi dilakukan dalam parafin cair yang ditempatkan
dalam inkubator bersuhu 60 – 70
o
C dan dilakukan secara bertahap tiga tahap, dengan lama pemaparan masing
– masing selama satu jam. Embedding dilakukan dengan memasukkan potongan jaringan ke dalam cetakan embedding yang
sebelumnya telah diisi parafin cair hingga cembung di atas plate panas pada embedding tissue consule. Cetakan embedding selanjutnya dipindahkan ke plate
dingin dan setelah parafin setengah membeku, label jaringan ditempelkan dan diapungkan di atas air dingin. Setelah parafin beku sempurna, hasil embedding
dapat dilepas dari cetakannya dan diiris – iris berbentuk segi empat, lalu
ditempelkan pada blok kayu. Hal selanjutnya yang dilakukan adalah pemotongan blok parafin, yaitu diawali dengan memasang blok jaringan pada mikrotom,
selanjutnya dilakukan pemotongan dengan ukuran 4 µm. Proses pemotongan dilakukan berkali
– kali hingga diperoleh potongan yang sempurna. Hasil potongan diambil dengan cara melekatkan pada kertas basah dan ditempatkan di
atas permukaan air dingin selama beberapa saat, pindahkan ke atas permukaan air hangat dan selanjutnya ditempelkan pada gelas objek. Kemudian dilakukan
deparafinisasi dan rehidrasi. Sediaan dimasukkan dalam xylol sebanayak tiga kali untuk melarutkan parafin. Rehidrasi dilakukan bertahap dengan cara memasukkan
sediaan ke dalam larutan alkohol bertingkat dari alkohol absolut tiga kali, 95, 90, 80, dan 70 dengan lama waktu pada masing
– masing tahap 2 – 5 menit. Tahap selanjutnya adalah pewarnaan Hematoksilin Eosin HE. Sediaan di
rendam di dalam hematoksilin selama lima menit kemudian direndam dalam air mengalir selama 10 menit. Selanjutnya dilakukan pewarnaan eosin selama 5
menit. Kemudian dilakukan dehidrasi di mulai dengan alkohol 70, 80, 90, 95 dan alkohol absolut I, II, dan III. Untuk penjernihan dilakukan dengan xylol
I, II, dan III. Kemudian dilanjutkan dengan mounting. Mounting adalah proses penutupan sediaan dengan menggunakan cover glass dengan bantuan perekat.
Proses mounting diawali dengan meneteskan 1 – 2 tetes entelan perekat di sisi
sediaan, selanjutnya cover glass diletakkan secara hati – hati agar perekat dapat
menyebar secara merata dan dapat menutupi seluruh permukaan sediaan dan diupayakan agar tidak terbentuk gelembung udara. Tahap terakhir yang dilakukan
adalah dokumentasi dengan menggunakan mikroskop cahaya yang dilengkapi kamera Nikon E600, Japan dengan lensa objektif 40x. Dokumen gambar diambil
dari beberapa lapang pandang.
3.2.4 Disosiasi Testis
Kategori