Waktu dan Tempat Analisis Data

III. BAHAN DAN METODE

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli – Desember 2008. Pembuatan preparat histologi dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor IPB. Dokumentasi hasil histologi dilakukan di Laboratorium Histologi, Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB. Disosiasi testis dan dokumentasinya dilaksanakan di Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar BBPBAT Sukabumi.

3.2 Prosedur Kerja

Tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah pengamatan preparat histologi yang bertujuan untuk mengetahui perkembangan morfologi sel testikular dan disosiasi gonad yang berfungsi untuk menghitung komposisi sel testikular ikan gurame.

3.2.1 Pengumpulan dan Penanganan Ikan Gurame

Ikan gurame uji untuk sementara waktu dipelihara di akuarium atau bak tandon. Kemudian sebanyak 18 ekor ikan gurame dikelompokkan berdasarkan tingkat perkembangan gonadnya, yaitu ikan yang belum berkembang gonadnya, ikan muda, ikan dewasa, dan ikan yang matang gonadnya. Jumlah ikan gurame yang belum berkembang gonadnya sebanyak lima ekor. Kemudian secara berturut-turut jumlah ikan muda, ikan dewasa, dan ikan yang matang gonadnya adalah 3, 3, dan 7 ekor. Berat tubuh ikan gurame yang digunakan berkisar antara 400 – 3200 g. Berat tubuh tersebut ditentukan dengan menggunakan timbangan manual dengan tingkat ketelitian 0,1 g. Ikan gurame diperoleh dari petani ikan di Petir dan Empang Bogor, pasar swalayan di Bogor, dan BBPBAT Sukabumi.

3.2.2 Penentuan IKG

IKG diketahui dengan cara membandingkan antara berat gonad ikan dengan berat tubuhnya. Setiap ikan gurame dibedah kemudian diambil gonadnya. Berat gonad ikan uji ditentukan dengan menggunakan timbangan digital dengan tingkat ketelitian 0,0001 g.

3.2.3 Pembuatan Preparat Histologi Testis

Setelah testis diambil dan ditimbang beratnya, testis dipotong menjadi dua bagian. Satu bagian digunakan untuk pembuatan preparat histologi testis dan bagian lainnya untuk disosiasi testis. Sebelum diproses secara histologis, testis dibersihkan pada larutan Phosphate Buffer Saline PBS. Testis difiksasi ke dalam larutan Bouin selama 48 jam. Kemudian dilakukan dehidrasi dengan cara memasukkan testis ke dalam alkohol 70 selama 24 jam. Setelah itu, testis dipindahkan ke dalam alkohol 80, 90, dan 95 yang masing – masing dilakukan selama 24 jam, sedangkan pada alkohol 100 absolut I, II, III, lama pemaparan masing – masing selama satu jam. Selanjutnya dilakukan penjernihan dengan cara memindahkan testis dari alkohol absolut III ke larutan penjernih xylol. Pemaparan dilakukan dalam xylol I 30 menit, xylol II 30 menit, dan xylol III 1 jam. Tahap berikutnya yang dilakukan adalah infiltrasi dan embedding. Infiltrasi dilakukan dalam parafin cair yang ditempatkan dalam inkubator bersuhu 60 – 70 o C dan dilakukan secara bertahap tiga tahap, dengan lama pemaparan masing – masing selama satu jam. Embedding dilakukan dengan memasukkan potongan jaringan ke dalam cetakan embedding yang sebelumnya telah diisi parafin cair hingga cembung di atas plate panas pada embedding tissue consule. Cetakan embedding selanjutnya dipindahkan ke plate dingin dan setelah parafin setengah membeku, label jaringan ditempelkan dan diapungkan di atas air dingin. Setelah parafin beku sempurna, hasil embedding dapat dilepas dari cetakannya dan diiris – iris berbentuk segi empat, lalu ditempelkan pada blok kayu. Hal selanjutnya yang dilakukan adalah pemotongan blok parafin, yaitu diawali dengan memasang blok jaringan pada mikrotom, selanjutnya dilakukan pemotongan dengan ukuran 4 µm. Proses pemotongan dilakukan berkali – kali hingga diperoleh potongan yang sempurna. Hasil potongan diambil dengan cara melekatkan pada kertas basah dan ditempatkan di atas permukaan air dingin selama beberapa saat, pindahkan ke atas permukaan air hangat dan selanjutnya ditempelkan pada gelas objek. Kemudian dilakukan deparafinisasi dan rehidrasi. Sediaan dimasukkan dalam xylol sebanayak tiga kali untuk melarutkan parafin. Rehidrasi dilakukan bertahap dengan cara memasukkan sediaan ke dalam larutan alkohol bertingkat dari alkohol absolut tiga kali, 95, 90, 80, dan 70 dengan lama waktu pada masing – masing tahap 2 – 5 menit. Tahap selanjutnya adalah pewarnaan Hematoksilin Eosin HE. Sediaan di rendam di dalam hematoksilin selama lima menit kemudian direndam dalam air mengalir selama 10 menit. Selanjutnya dilakukan pewarnaan eosin selama 5 menit. Kemudian dilakukan dehidrasi di mulai dengan alkohol 70, 80, 90, 95 dan alkohol absolut I, II, dan III. Untuk penjernihan dilakukan dengan xylol I, II, dan III. Kemudian dilanjutkan dengan mounting. Mounting adalah proses penutupan sediaan dengan menggunakan cover glass dengan bantuan perekat. Proses mounting diawali dengan meneteskan 1 – 2 tetes entelan perekat di sisi sediaan, selanjutnya cover glass diletakkan secara hati – hati agar perekat dapat menyebar secara merata dan dapat menutupi seluruh permukaan sediaan dan diupayakan agar tidak terbentuk gelembung udara. Tahap terakhir yang dilakukan adalah dokumentasi dengan menggunakan mikroskop cahaya yang dilengkapi kamera Nikon E600, Japan dengan lensa objektif 40x. Dokumen gambar diambil dari beberapa lapang pandang.

3.2.4 Disosiasi Testis

Sebelum dilakukan proses disosiasi, bagian permukaan luar testis dibersihkan menggunakan larutan PBS. Tahap pertama yang dilakukan adalah testis dipotong kecil – kecil sepanjang 0,5 cm di cawan petri. Kemudian potongan testis dicacah sampai sedemikian kecil selama 3 – 5 menit. Setelah itu, larutan tripsin 0,5 tripsin dilarutkan di dalam PBS dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi potongan testis sebanyak 2 ml. Tahap berikutnya adalah testis tersebut dicacah kembali dan dipipetteteskan dengan menggunakan mikropipet selama 3 – 5 menit sampai terlihat buih. Selanjutnya, diambil larutan hasil cacahan testis sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam mikrotube. Dari mikrotube diambil kembali larutan hasil cacahan testis sebanyak 2 µl dan diteteskan ke dalam gelas objek cekung. Hal selanjutnya adalah dilakukan pengamatan di bawah mikroskop Olympus SZX16 yang telah dilengkapi kamera dan langsung terhubung ke 15 komputer yang telah ter – install software DP20. Selang lima menit kemudian, diambil kembali hasil cacahan testis dari mikrotube sebanyak 2 µl dan kembali dilakukan pengamatan di bawah mikroskop. Sisa larutan cacahan testis yang terdapat di mikrotube disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 15.800 rpm. Kemudian supernatan hasil sentrifus dibuang dan diganti dengan PBS sebanyak 1 µl. Hal ini dilakukan agar sel – sel spermatogenik tidak rusak dan memutus kerja tripsin. Setelah itu, diambil kembali dengan menggunakan mikropipet sebanyak 1 µl dan diteteskan ke dalam gelas objek cekung dan dilakukan kembali pengamatan.

3.2.5 Pengamatan Hasil

3.2.5.1 Karakterisasi Morfologi Sel Testikular

Karakterisasi morfologi sel testikular ikan gurame dilakukan untuk mengetahui perbedaan tipe sel – sel spermatogenik pada ikan gurame, yaitu spermatogonia, spermatosit, spermatid, dan spermatozoa. Karakterisasi dilakukan dengan mengamati preparat histologi testis yang telah selesai dibuat di bawah mikroskop cahaya yang dilengkapi kamera Nikon E600, Japan dengan lensa objektif 40x dan kemudian dibandingkan dengan hasil histologi yang telah dilakukan berdasarkan kriteria Takashima dan Hibiya 1995 dan Blazer 2002. Preparat histologi testis yang diamati sebanyak enam buah, yang terdiri dari preparat histologi testis ikan gurame muda sebanyak satu buah, ikan gurame dewasa sebanyak dua buah, dan ikan gurame yang matang gonad sebanyak tiga buah.

3.2.5.2 Penghitungan Komposisi dan Pengukuran Diameter Sel Testikular

Penghitungan komposisi sel testikular ikan gurame dilakukan untuk mengetahui jumlah sel – sel spermatogenik, yaitu spermatogonia, spermatosit, spermatid, dan spermatozoa. Akan tetapi, pada penelitian ini spermatozoa tidak dihitung. Sel testikular hasil disosiasi dihitung langsung di bawah mikroskop Olympus SZX16 yang telah dilengkapi kamera dan terhubung ke komputer yang memiliki software DP20 yang berguna dalam penghitungan sel. 16 Pengukuran diameter sel testikular bertujuan untuk mengetahui ukuran sel- sel spermatogenik. Pengukuran diameter sel testikular dilakukan dengan cara membuat garis skala dan kemudian dibandingkan dengan diameter sel-sel spermatogenik. Selanjutnya hasil pengukuran dikelompokkan ke dalam beberapa kelas. Ukuran diameter sel – sel spermatogenik dari yang terkecil sampai yang terbesar adalah spermatozoa, spermatid, spermatosit, dan spermatogonia. Untuk mengetahui perbedaan morfologi pada masing – masing sel spermatogenik hasil disosiasi testis dilakukan perbandingan dengan hasil histologi testis sebelumnya dan hasil disosiasi testis yang telah dilakukan berdasarkan kriteria Okutsu et al. 2005. Hasil disosiasi testis yang dihitung komposisi dan diukur sel testikular berasal dari empat ekor ikan gurame, yang terdiri dari disosiasi testis ikan gurame muda sebanyak satu ekor, ikan gurame dewasa sebanyak satu ekor, dan ikan gurame yang matang gonad sebanyak dua ekor.

3.2.5.3 Proporsi Spermatogonia

Proporsi spermatogonia diketahui dengan cara membandingkan antara jumlah sel spermatogonia dengan jumlah total sel testikular, dan hasilnya dalam bentuk persen .

3.3 Analisis Data

Data yang diperoleh disajikan dalam bentuk tabel, grafik, dan gambar serta dianalisis secara deskriptif untuk setiap penentuan IKG, perkembangan morfologi, dan proporsi komposisi sel testikular ikan gurame. 17

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.1.1 IKG

Gambar 7. Grafik hubungan antara berat ikan dengan berat gonad. Secara keseluruhan nilai rata – rata berat gonad ikan gurame berkisar antara 0,0755 – 0,2517 g Gambar 7. Nilai rata – rata berat gonad tertinggi 0,2517 g terdapat pada ikan yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan yang matang gonad 2250 – 3200 g, sedangkan nilai rata – rata berat gonad terendah 0,0755 g terdapat pada ikan yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan muda 800 – 1000 g. Adapun ikan yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan yang belum berkembang gonadnya 400 – 600 g, gonad relatif sulit untuk diidentifikasi atau ditemukan dari lima ekor ikan gurame yang telah diperiksa. Dari Gambar 7 dapat dilihat bahwa semakin besar berat ikan maka semakin meningkat pula berat gonad. Nilai rata – rata IKG ikan gurame berkisar antara 8,7025 x 10 -3 – 9,5382 x 10 -3 Gambar 8. Nilai rata – rata IKG tertinggi 9,5382 x 10 -3 juga terdapat pada ikan yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan yang matang gonad 2250 – 3200 g, sedangkan nilai rataan IKG terendah 8,7025 x 10 -3 juga terdapat pada 0,0755 n = 3 0,1078 n = 3 0,2347 n = 7 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Be rat G onad g Berat Ikan g Ikan Muda Ikan Dewasa Ikan Matang Gonad 800 – 1000 1100 – 1300 2250 – 3200