28 biarkan sekurang-kurangnya selama 3 jam. Pindahkan massa sedikit demi sedikit
ke dalam perkolator sambil tiap kali di tekan hati-hati, tuangi cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat
selapis cairan penyari, perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam. Cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml tiap menit, cairan penyari ditambahkan
berulang-ulang secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari diatas simplisia. Perkolasi dihentikan hingga 500 mg perkolat yang keluar terakhir
diuapkan tidak meninggalkan sisa. Perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat penguap rotary evaporator Depkes RI,
a.
2000. Bagan pembuatan ekstrak
etanol dapat dilihat pada Lampiran 7, halaman 52.
3.7.1 Pembuatan fraksi-fraksi dari ekstrak etanol
Sebanyak 30 g ekstrak etanol dilarutkan dengan 60 ml etanol dan ditambahkan 150 ml air suling, dimasukkan ke dalam corong pisah, ditambahkan
150 ml n-heksana, dikocok, didiamkan sampai lapisan terpisah, pisahkan, diambil lapisan n-heksana dan diuapkan. Lapisan air ditambahkan 150 ml etilasetat,
dikocok, didiamkan sampai lapisan terpisah, pisahkan, diambil lapisan etilasetat, diuapkan, selanjutnya diambil fraksi air dan diuapkan. Masing-masing fraksi di uji
aktivitas antibakteri. Bagan pembuatan fraksi dapat dilihat pada Lampiran 7, halaman 53.
3.8 Sterilisasi Alat
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di dalam oven pada
suhu 170°C selama 1 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Jarum ose dan pinset disterilkan dengan lampu bunsen Lay, 1994.
29
3.9 Pembuatan Media 3.9.1 Media nutrient agar NA
Komposisi: Lab-Lemco Powder 1 gL Yeast Extract
2 gL Peptone
5 gL Sodium Chloride
5 gL Agar
15 gL Cara pembuatan: Sebanyak 28 g nutrien agar NA disuspensikan kedalam air
suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai bahan larut sempurna dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Oxoid, 1982.
3.9.2 Media nutrient broth NB
Komposisi: Lab-Lemco Powder 1 gL
Yeast Extract 2 gL
Peptone 5 gL
Sodium Chloride 5 gL
Cara pembuatan : Sebanyak 13 g media nutrient broth NB dilarutkan dengan air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut sempurna, kemudian media
dimasukkan dalam erlenmeyer steril yang bertutup dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Oxoid, 1982.
3.10 Pembuatan Media Agar Miring
Tabung reaksi yang steril dimasukkan 3 ml media nutrient agar steril yang sebelumnya sudah dicairkan, kemudian didiamkan sampai memadat pada posisi
miring membentuk sudut 30-45º dan disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5ºC.
30
3.11 Pembuatan Stok Kultur
Biakan bakteri Staphylococcus aureus diambil dengan jarum ose steril lalu diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar miring dengan cara
menggores, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35 ± 2°C selama 18- 24 jam. Prosedur yang sama juga dilakukan pada biakan bakteri Escherichia coli.
Bagan pembuatan stok kultur dapat dilihat pada Lampiran 7, halaman 54.
3.12 Penyiapan Inokulum Bakteri
Koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dari stok kultur menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml media
nutrient broth steril lalu diinkubasikan pada suhu 35 ± 2°C sampai didapat kekeruhan dengan transmitan 25 menggunakan alat spektrofotometer UV
panjang gelombang 580 nm Ditjen POM, 1995. Prosedur yang sama juga dilakukan untuk koloni bakteri Escherichia coli. Bagan pembuatan inokulum
bakteri dapat dilihat pada Lampiran 7, halaman 54.
3.13 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Etanol, Fraksi n-Heksana, Fraksi Etilasetat dan Fraksi Air Kulit Buah Sawo Manila dengan Berbagai
Konsentrasi Ekstrak etanol dan fraksi air masing-masing ditimbang sebanyak 1 g,
kemudian dilarutkan dalam dimetilsulfoksida DMSO sebanyak 2 ml sedangkan fraksi n-heksana dan fraksi etilasetat masing-masing ditimbang sebanyak 0,5 g,
kemudian dilarutkan dalam dimetilsulfoksida DMSO sebanyak 1 ml. Masing- masing diaduk hingga larut dan didapat konsentrasi 500 mgml, kemudian dibuat
pengenceran dengan konsentrasi 400 mgml, 300 mgml, 200 mgml, 100 mgml dan 50 mgml.
31
3.14 Pengujian Aktivitas Antibakteri Secara In Vitro
