79
bereaksi sempurna dengan radikal bebas sehingga memberikan absorbansi yang cenderung tetap. Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa operating time untuk reaksi
antara radikal DPPH dengan larutan pembanding rutin dan larutan uji adalah 30 menit.
3. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Penentuan panjang gelombang serapan maksimum bertujuan untuk menentukan panjang gelombang dimana senyawa yang akan diukur memberikan
absorbansi yang paling maksimal. Pengukuran senyawa perlu dilakukan pada panjang gelombang serapan maksimum karena pada panjang gelombang serapan maksimum,
perubahan sedikit konsentrasi pada sampel akan memberikan perubahan yang besar pada absorbansi sampel sehingga diharapkan akan didapatkan sensitivitas yang
maksimum. Dalam penelitian ini, pengukuran dilakukan terhadap serapan dari larutan DPPH. Larutan DPPH akan memberikan serapan berwarna ungu karena adanya
gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kimianya. Menurut Dehpour 2009, panjang gelombang teoretis untuk pengukuran
DPPH berkisar antara 517 nm. Tetapi tetap diperlukan suatu pemastian dalam penentuan panjang gelombang maksimum karena panjang gelombang serapan
maksimum dapat mengalami perubahan pergeseran dikarenakan perbedaan kondisi percobaan yang dilakukan. Perubahan tersebut dapat berupa perbedaan instrumen,
waktu pengukuran, pelarut, iklim, maupun individu yang melakukan. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan terhadap
larutan kontrol, yaitu larutan DPPH dalam pelarut metanol pada tiga tingkatan
80
konsentrasi. Scanning dilakukan pada panjang gelombang 400-600 nm. Digunakan
larutan kontrol, tanpa penambahan larutan sampel bertujuan untuk mendapatkan serapan DPPH saja tanpa adanya gangguan serapan dari senyawa-senyawa dalam
sampel.
Tabel VIII. Hasil scanning panjang gelombang maksimum DPPH
Konsentrasi larutan DPPH
Panjang gelombang χ maksimum
hasil scanning Panjang gelombang
χ maksimum yang digunakan
Panjang gelombang
χ maksimum
teoretis 0,016 mM
516 nm 515,5 nm
517 nm 0,048 mM
515,5 nm 0,080 mM
514,5 nm Hasil scanning panjang gelombang pada tiga tingkatan konsentrasi disajikan
dalam tabel VIII. Hasil yang didapatkan ini berbeda dengan panjang gelombang teoretis DPPH yaitu 517 nm. Panjang gelombang maksimum yang digunakan dalam
penelitian ini adalah 515,5 nm, panjang gelombang ini masih diperbolehkan sesuai dengan ketentuan yang tercantum dalam Farmakope Indonesia IV 1995, dimana
batas pergeseran yang diperkenankan adalah maksimum sebesar 2 nm. Oleh karena itu, panjang gelombang maksimum yang digunakan pada penelitian ini adalah 515,5
nm masih memenuhi kriteria.
4. Hasil validasi metode analisis pengujian aktivitas antioksidan
