30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 30
BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai Bulan Maret hingga Bulan Mei 2015 di Laboratorium Penelitian I, Laboratorium Penelitian II, Laboratorium
Farmakognosi dan Fitokimia, Laboratorium Kimia Obat dan Laboratorium Formulasi Sediaan Steril FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.2 Bahan dan Alat
3.2.1 Bahan Uji
Bahan uji yang digunakan adalah buah parijoto Medinilla speciosa
Blume dengan spesifikasi warna merah muda keunguan dan rasa asam sepat yang berasal dari Desa Colo, Kabupaten Kudus, Jawa Tengah. Bahan
selanjutnya yang digunakan adalah sel darah merah yang diisolasi dari whole blood darah lengkap yang masih segar dengan batas kadaluarsa 30
hari. Darah yang digunakan adalah golongan darah B dan diperoleh dari PMI Palang Merah Indonesia DKI Jakarta. Sel darah merah yang
dibutuhkan untuk uji ini adalah sel darah yang belum mengalami lisis.
3.2.2 Bahan Kimia
Etanol 70, kloroform, asam sulfat H
2
SO
4
, pereaksi Dragendorff, pereaksi Mayer, asam klorida HCl, aquades, natrium klorida NaCl, feri
klorida FeCl
3
, amoniak NH
3
, dinatrium hydrogen posfat dihidrat Na
2
HPO
4
. 2H
2
O, natrium dihidrogen posfat monohidrat NaH
2
PO
4
. H
2
O, natrium hidroksida NaOH, natrium diklofenak PT. Indofarma.
3.2.3 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari peralatan gelas standar, tabung gelap, mikropipet Mettler Toledo 200 µL, mikropipet
Mettler Toledo 1000 µL, neraca analitik, vacuum rotary evaporator, spatula, seperangkat alat spektrofotometer UV-Vis, vial, waterbath,
31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sentrifugator, tabung sentrifus, autoklaf, spuit, pH meter, vortex, mikrotips, dan termometer.
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Determinasi
Buah parijoto Medinilla speciosa Blume yang digunakan pada
penelitian ini dilakukan determinasi terlebih dahulu di Herbarium
Bogoriense LIPI Bogor untuk menentukan apakah buah yang digunakan
pada penelitian ini benar jenis Medinilla speciosa Blume, suku
Melastomaceae, Parijoto.
3.3.2 Penyiapan Bahan
Buah parijoto Medinilla speciosa Blume yang digunakan pada
penelitian ini diambil pada Bulan Desember 2014 dari Desa Colo, Kabupaten Kudus, Jawa Tengah. Buah parijoto disortasi untuk dipisahkan
dari kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing sehingga dapat mengurangi jumlah pengotor yang ikut terbawa dalam bahan uji, kemudian dicuci
dengan air mengalir dan dikering anginkan hingga tidak terdapat sisa air. Buah segar yang telah didapatkan kemudian dihaluskan dengan blender
dan dilakukan ekstraksi.
3.3.3 Pembuatan Ekstrak
Buah segar parijoto Medinilla speciosa Blume yang telah
dihaluskan dimaserasi dengan etanol 70 selama 48 jam, dan dilakukan secara terus menerus hingga hasil maserasi atau maserat yang diperoleh
hampir jernih. Hasil maserasi kemudian diuapkan dengan menggunakan alat vacuum rotary evaporator pada suhu 40
C hingga didapatkan ekstrak kental dengan kadar air kurang dari 10 yang merupakan ekstrak kasar.
3.3.4 Penapisan Fitokimia
Penapisan fitokimia dilakukan terhadap ekstrak kasar yang telah diperoleh. Uji penapisan fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid,
32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
flavonoid, saponin, tanin, glikosida, dan terpenoid. Berikut prosedur masing-masing pengujian.
I. Identifikasi senyawa alkaloid
Ekstrak ditimbang 10 mg, lalu ditambahkan 10 mL kloroform diaduk rata. Campuran disaring dan dimasukkan kedalam tabung reaksi,
kemudian ditambahkan 0,5 mL H
2
SO
4
1 M dan dikocok baik-baik, dibiarkan beberapa saat. Lapisan atas yang jernih dipipet kedalam 2
tabung reaksi kecil. Salah satunya diberikan pereaksi Dragendorff dan tabung lainnya pereaksi Mayer 2-3 tetes. Reaksi positif apabila
menunjukkan endapan kuning jingga orange dengan pereaksi Drogendorf dan endapan putih dengan pereaksi Mayer Guevara, 1985
dalam Wachidah, 2013.
II. Identifikasi Senyawa Flavonoid
Ekstrak parijoto ditetesi dengan larutan NaOH. Adanya perubahan menjadi warna kuning dan ketika ditambahkan larutan asam warna
menjadi pudar menunjukkan hasil positif adanya flavonoid Tiwari et al., 2011.
III. Identifikasi Senyawa Saponin
Uji Forth Ekstrak ditimbang 10 mg, lalu ditambahkan 10 ml air panas.
Selanjutnya dikocok kuat selama 10 detik, akan terbentuk buih yang mantap setinggi 1-10 cm selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 1 tetes
HCl 2N dan diamati Guevera, 1985 dalam Wachidah, 2013.
IV. Identifikasi Senyawa Tanin
0,5 g ekstrak direbus dalam 10 mL air dalam tabung reaksi dan disaring, kemudian ditambahkan beberapa tetes FeCl
3
0,1 dan diamati, positif jika terbentuk warna hijau kecoklatan atau biru kehitaman Ayoola
et al., 2008.
33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
V. Identifikasi Senyawa Glikosida
Metode Keller-Killiani Ekstrak sebanyak 10 mg ditambahkan 3 ml pereaksi FeCl
3
kemudian diaduk dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi. Diteteskan 1 ml larutan
asam sulfat pekat melalui dinding tabung reaksi. Biarkan campuran beberapa lama sehingga terbentuk warna merah kecoklatan, yang mungkin
berubah menjadi biru atau lembayung. Perubahan tersebut menunjukkan reaksi positif terhadap 2-deoksi-gula Guevera, 1985 dalam Wachidah,
2013.
VI. Identifikasi Terpenoid
Sebanyak 0,5 g ekstrak ditimbang kemudian ditambahkan 2 ml kloroform. Sebanyak 3 ml H
2
SO
4
ditambahkan dengan hati-hati untuk membentuk lapisan. Perubahan warna menjadi coklat kemerahan yang
terdapat pada antar lapisan mengindikasikan adanya terpenoid Ayoola et al., 2008.
3.3.5 Pengamatan Organoleptis
Organoleptis ekstrak dinyatakan melalui pengamatan dengan panca indera, mendeskripsikan bentuk, warna, bau, dan rasa ekstrak Departemen
Kesehatan Republik Indonesia, 2000.
3.3.6 Uji Kadar Air
Parameter non spesifik kadar air dilakukan terhadap ekstrak kasar. Ekstrak ditimbang sebanyak 1 gram dalam wadah yang telah ditara.
Kemudian dikeringkan pada suhu 105 C selama lima jam dan ditimbang.
Pengeringan dilanjutkan dan ditimbang pada jarak satu jam sampai perbedaan antara dua penimbangan berturut
– turut tidak lebih dari 0,25 Depkes RI, 2000
34
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.7 Uji Aktivitas Anti Inflamasi Metode Stabilisasi Membran Eritrosit
3.3.7.1 Pembuatan Larutan yang Dibutuhkan
a. Pembuatan Dapar Posfat 0,15 M pH 7,4
Sebanyak 2,67 gram dinatrium hidrogen posfat dihidrat Na
2
HPO
4
. 2H
2
O dilarutkan dalam 100 mL aquades. Kemudian sebanyak 2,07 gram natrium dihidrogen posfat monohidrat NaH
2
PO
4
. H
2
O dilarutkan dalam 100 mL aquades. Kemudian 81 mL larutan Na
2
HPO
4
. 2H
2
O 0,15 M dicampurkan dengan 19 mL NaH
2
PO
4
. H
2
O 0,15 M pada suhu ruang Ruzin, 1999. Kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf 121
C.
b. Pembuatan Larutan Isosalin
Sebanyak 0,85 gram NaCl dilarutkan dalam dapar posfat 0,15 M pH 7,4 kemudian di add hingga volumenya 100 mL Kumar et al., 2011 dan
Oyedapo et al., 2010. Kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf 121
C selama 15 menit.
c. Pembuatan Larutan Hiposalin
Sebanyak 0,25 gram NaCl dilarutkan dalam dapar posfat 0,15 M pH 7,4 kemudian di add hingga volumenya 100 mL Kumar et al., 2011 dan
Oyedapo et al., 2010. Kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf 121
C selama 15 menit.
d. Penyiapan Konsentrasi Sampel Uji dan Natrium Diklofenak
Sebanyak 500 mg ekstrak dilarutkan dalam 5 mL etanol 70 lalu diencerkan dengan isosalin sampai 50 mL 10000 ppm pada suhu ruang,
selanjutnya encerkan larutan tersebut menjadi 50, 100, 500, dan 1000 ppm, masing
– masing seri konsentrasi dibuat triplo. Kemudian 5 mg natrium diklofenak dilarutkan dalam 1 mL etanol 70 lalu diencerkan dengan
isosalin sampai 50 mL 100 ppm pada suhu ruang.
35
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.7.2 Pembuatan Suspensi Sel Darah Merah
Darah yang telah diperoleh dari PMI Palang Merah Indonesia dimasukkan ke dalam tabung sentrifus sebanyak 10 mL. Selanjutnya
disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang. Supernatan yang dihasilkan dipisahkan, kemudian residu yang dihasilkan
dicuci kembali dengan menggunakan larutan isosalin dan disentrifus kembali. Proses tersebut diulangi sebanyak tiga kali hingga larutan isosalin
berwarna jernih Oyedapo et al., 2010. Lalu dibuat suspensi sel darah merah 10 dengan mencampurkan 2 mL sel darah merah dengan 18 mL
larutan isosalin Saleem et al., 2011.
3.3.7.3 Pengujian Aktivitas Anti Inflamasi Ekstrak Etanol 70 Buah
Parijoto terhadap Stabilisasi Membran Eritrosit a.
Pembuatan Larutan Uji
Dibuat larutan uji dengan mencampurkan 1 mL larutan sampel, 1 mL dapar posfat, 2 mL hiposalin dan 0,5 mL suspensi 10 sel darah merah.
b. Pembuatan Larutan Kontrol Positif
