BAB 3
BAHAN DAN METODA
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Maret sampai Oktober tahun 2009 bertempat di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun andaliman yang berasal dari desa Lae Tanggiang, Kabupaten Dairi, Sumatera Utara. Bahan kimia yang
digunakan adalah bahan-bahan zat penyusun media ½ MS, zat pengatur tumbuh BAP dan 2,4-D, agar, HCl 0,1N, NaOH 0,1N, air kelapa, akuades, alkohol 70, diktan 0,1
g100ml, HgCl
2
0,05, bayclin 10 dan 20, dan tween 80. Alat-alat yang digunakan adalah botol kultur, pisau, gunting, pinset, autoklaf, neraca analitik, pemanas, shaker,
gelas ukur, cawan petri, kertas saring, spatula, pipet tetes, pipet serologi, propipet, handsprayer, bunsen, pH meter, kertas pembungkus, aluminium foil, tissu gulung,
kertas label, selotip, karet, entkas, dan rak kultur yang dilengkapi dengan lampu fluorescent neon 500 lux.
3.3 Metoda Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode percobaan dengan Rancangan Acak Lengkap RAL faktorial dengan 2 faktor, yaitu:
Universitas Sumatera Utara
I. Faktor lamanya waktu perendaman T T
1
: selama 30 menit T
2
: selama 60 menit T
3
: selama 90 menit II. Faktor konsentrasi EMS C
C : kontrol
C
1
: konsentrasi 0,05 C
2
: konsentrasi 0,10 C
3
: konsentrasi 0,15 C
4
: konsentrasi 0,20
Sehingga diperoleh 15 kombinasi yaitu: C
T
1
C
1
T
1
C
2
T
1
C
3
T
1
C
4
T
1
C T
2
C
1
T
2
C
2
T
2
C
3
T
2
C
4
T
2
C T
3
C
1
T
3
C
2
T
3
C
3
T
3
C
4
T
3
Dibuat dalam 1 set perlakuan dengan 5 kali ulangan
3.4 Prosedur Kerja 3.4.1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini seperti cawan petri, botol kultur, pipet serologi, aluminium foil, kertas saring, dan pinset dicuci dengan deterjen dan dibilas
dengan air mengalir, dikeringkan dan disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 C
dengan tekanan 17,5 psi selama 60 menit. Bersamaan dengan alat dimasukkan juga botol berisi akuades yang ikut dalam sterilisasi alat.
3.4.2 Pembuatan Media
Media yang digunakan adalah media 12 MS dengan penambahan zat pengatur tumbuh BAP dan 2,4-D dengan konsentrasi masing-masing 0,5 mgl. Tahap awal
pembuatan media adalah pembuatan larutan stok terlebih dahulu yaitu hara makro,
Universitas Sumatera Utara
mikro, iron, dan vitamin. Unsur-unsur lain ditimbang sesuai kebutuhan seperti sukrosa dan agar. Pembuatan media sebanyak 1000 ml.
Unsur-unsur hara makro, mikro, iron, vitamin, sukrosa, ZPT, dan air kelapa 150 mll dimasukkan ke dalam gelas piala dan ditambah dengan akuades sehingga
volumenya menjadi 1 L. Pada media tersebut kemudian ditambahkan zat pengatur tumbuh BAP dan 2,4-D dengan konsentrasi masing-masing 0,5 mgl. Keasaman
media diukur dengan menggunakan pH meter sekitar 5,8. Untuk mendapatkan keasaman yang diharapkan, ditambah dengan HCl 0,1 N atau NaOH 0,1 N. Ke dalam
media dimasukkan agar, lalu dipanaskan hingga larutan menjadi bening. Larutan tersebut kemudian dituang ke dalam botol kultur lalu ditutup dengan aluminium foil
dan dikencangkan dengan karet gelang. Lalu media diautoklaf pada suhu 121 C
dengan tekanan 17,5 psi selama 30 menit, lalu disimpan di ruang kultur lebih kurang selama 1 minggu sebelum digunakan.
3.4.3 Sterilisasi Eksplan
Eksplan berupa daun andaliman dipotong ± 2 cm dengan menggunakan pisau tajam dan steril. Daun dibersihkan dengan air mengalir hingga bersih. Daun direndam dalam
larutan diktan 0,1 g100ml dan dishaker pada 100 rpm selama 6 jam. Daun dibersihkan dengan alkohol 70 selama 5 menit, dibilas dengan akuades steril 3 kali.
Daun direndam dalam larutan HgCl
2
0,05 dan dishaker selama 1 jam, dibilas lagi sebanyak 3 kali dengan akuades steril. Daun berturut-turut disterilkan dengan larutan
klorox 20 dan 10 yang ditetesi dengan Tween 20 sebanyak 2 tetes selama 5 menit. Daun dibilas 3 kali dengan akuades steril. Daun dikeringkan di atas kertas saring steril
dalam cawan petri.
3.4.4 Perlakuan EMS
Daun andaliman yang telah disterilkan dikulturkan pada media MS cair yang telah diperlakukan EMS sesuai perlakuan, lalu diinkubasi dengan waktu sesuai dengan
Universitas Sumatera Utara
perlakuan. Setelah itu dibilas dengan air steril 3 kali lalu ditumbuhkan pada media MS padat.
3.4.5 Penanaman Eksplan
Penanaman eksplan dilakukan di dalam entkas. Botol-botol berisi media yang sudah disterilkan, dibuka tutupnya dengan menggunakan pinset yang sudah dicelupkan pada
alkohol dan telah dibakar. Di dalam entkas disediakan juga 2 lampu bunsen untuk mencegah kontaminasi. Setelah tutup botol dibuka, bagian sekitar mulut botol
dilewatkan di atas api bunsen untuk memperkecil kontaminasi. Eksplan yang telah disterilkan, diambil dari dalam cawan petri dan dimasukkan ke dalam botol kultur
dengan menggunakan pinset steril. Botol kultur ditutup dengan aluminium foil dan disusun di rak kultur.
Gambar 2. Penanaman Daun Andaliman pada Media MS
3.4.6 Pemeliharaan Kultur Daun
Eksplan yang telah ditanam di dalam botol kultur diletakkan pada rak pemeliharaan dengan kondisi ruangan yang steril, suhu berkisar antara 25
C. Intensitas cahaya dengan penyinaran lampu neon 500 lux. Botol-botol yang berisi eksplan tersebut
disusun dengan rapi sehingga memudahkan dalam pengamatan. Ruangan diupayakan dalam keadaan steril atau dengan menyemprotkan alkohol 70 setiap harinya sampai
eksplan membentuk kalus atau planlet.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 3. Pemeliharaan Kultur Daun Andaliman
3.4.7 Parameter Pengamatan
Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah:
Pengamatan secara kuantitatif a.
Persentase kultur yang hidup persentase kultur yang hidup = jumlah eksplan yang berkalus x 100
jumlah eksplan per berat basah kultur b.
Pertumbuhan kalus setelah diinduksi EMS Ethyl Methana Sulphonate c.
Warna kalus d.
Berat basah kultur g e.
Persentase kultur terkontaminasi Persentase kultur terkontaminasi dihitung selama 6 minggu pengamatan sejak
awal hingga akhir penelitian persentase kultur terkontaminasi = jumlah eksplan yang terkontaminasi x 100
jumlah eksplan seluruh perlakuan
3.5 Analisis Data
Data penelitian menggunakan metode RAL ini dianalisis dengan Analysis of Variace ANOVA. Sedangkan untuk menguji beda antar perlakuan dilakukan dengan Uji
Jarak Duncan UJD atau sering disebut Duncan Multiple Range Test DMRT Sastrosupadi, 2004.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Persentase kultur yang hidup
Persentase kultur yang hidup adalah banyaknya kultur hidup dari seluruh eksplan yang ditanam. Data pengamatan persentase kultur yang hidup dapat dilihat pada Tabel 4.1.1
Dari data tersebut didapat bahwa jumlah kultur yang hidup yaitu sebanyak 46 botol atau 61,33. Jumlah ini menunjukkan bahwa ada pengaruh pemberian EMS dan lama
perendaman terhadap pertumbuhan kalus daun tanaman andaliman Zanthoxylum
acanthopodium DC. secara in vitro.
Secara umum pemberian berbagai konsentrasi EMS Ethyl Methana Sulphonate memberi persentase kultur hidup yang lebih tinggi jika dibandingkan
dengan tanpa perlakuan kontrol yaitu sebesar 100 yang didapat pada perlakuan C
1
T
2
. Hal ini menunjukkan bahwa ada pengaruh pemberian EMS dan lama perendaman terhadap pertumbuhan kalus pucuk andaliman.
Tabel 4.1.1 Persentase Kultur yang Hidup
Konsentrasi C
Lama Perendaman T Total
T
1
T
2
T
3
C C
1
C
2
C
3
C
4
3 60 4 80
3 60 3 60
3 60 3 60
5 100 3 60
3 60 2 40
3 60 3 60
3 60 3 60
2 40 9 60
1280 960
960 746,67
Total 1621,33
1621,33 1418,67
46 61,33 Ket : C
= 0,0 mgl C
3
=0,15mgl T
1
= 30 menit C
1
= 0,05mgl C
4
=0,20mgl T
2
= 60 menit
C
2
= 0.10mgl T
3
= 90 menit
Universitas Sumatera Utara
Pada Tabel 4.1.1 dapat dilihat bahwa hampir pada semua perlakuan terdapat kultur yang hidup. Pada perlakuan C
1
T
2
memiliki jumlah kultur hidup yang lebih besar yakni 100. Sedangkan untuk perlakuan yang memiliki jumlah kultur hidup
yang paling sedikit adalah pada perlakuan C
4
T
2
dan C
4
T
3
yakni masing-masing sebesar 40. Hal ini menunjukkan bahwa EMS pada konsentrasi 0,05 dengan lama
perendaman 60 menit dapat memacu kultur hidup kalus. Sedangkan untuk konsentrasi EMS 0,20 dengan lama perendaman 60 dan 90 menit dapat menurunkan persentase
kultur hidup dari kultur daun andaliman.
Menurut Priyono Agung 2002 penggunaan EMS Ethyl Methana Sulphonate pada konsentrasi rendah 0,05 dapat merangsang pertumbuhan dan
juga berfungsi sebagai agen mutasi. Hal serupa terjadi pada penggunaan 2,4-D. Pada konsentrasi tinggi 2,4-D berfungsi sebagai herbisida yang dapat mematikan sel
tanaman. Namun, pada konsentrasi rendah dapat berfungsi sebagai zat pengatur tumbuh yang dapat memacu pertumbuhan kalus.
Konsentrasi dan lama perendaman EMS yang tinggi dapat menghambat jaringan untuk tumbuh. Sama halnya dengan mutagen kimia lainnya seperti kolkhisin
bila digunakan pada konsentrasi tinggi dan waktu perendaman yang lama dapat mengakibatkan gangguan fisiologi pada tanaman. Hal tersebut sesuai dengan
pernyataan Suryo 1995 bahwa jika konsentrasi larutan kolkhisin dan lama waktu perlakuan tidak tepat, maka kolkhisin akan memperlihatkan pengaruh negatif yaitu
berupa kerusakan sel-sel tanaman bahkan menyebabkan matinya tanaman.
Greene, et al., 2005 dalam jurnalnya menambahkan bahwa peningkatan senyawa mutagenik pada jaringan tanaman dapat mempengaruhi sistem metabolisme
tanaman tersebut. Pemberian mutagen pada jaringan tanaman dapat berdampak buruk apabila tidak sesuai dengan kemampuan jaringan tanaman untuk mengoptimalkan
mutagen tersebut.
Universitas Sumatera Utara
4.2 Pertumbuhan kalus setelah diinduksi EMS Ethyl Methana Sulphonate
Kategori