- 3 = Luas tampilan warna coklat 50 yang terwarnai
positif.
3.8. Bahan dan Alat Penelitian Bahan
-bahan yang dibutuhkan dalam penelitian
a. Ekstrak etanol kulit manggis yang didapat dari Pericarp buah manggis yang telah dideterminasi di Herbarium Medanense Jurusan Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam MIPA Universitas Sumatera Utara. b. MSG
c. Vitamin E d. Mencit jantan strain DDW dengan umur 8-12 minggu, mempunyai berat
badan berkisar 25 – 30 gram, berasal dari FMIPA USU.
e. Pakan standar mencit berupa pellet produksi PT. Charoen Pokphan Medan yang dicampur jagung halus dengan perbandingan 2 : 1.
f. Reagensia untuk pembuatan preparat histologi ginjal. g. Reagensia untuk pewarnaan HE.
h. Regensia untuk pewarnaan immunohistokima antioksidan copper zinc superoxide dismutase Cu Zn SOD.
Peralatan yang dibutuhkan dalam penelitian
a. Kandang mencit dan perlengkapannya b. Jarum gavage untuk cekok tikus, timbangan, sekam padi.
c. Peralatan pembuatan preparat histologi ginjal d. Peralatan pewarnaan HE
Universitas Sumatera Utara
e. Peralatan untuk pewarnaan immunohistokomia antioksidan copper zinc superoxide dismutase Cu Zn SOD
f. Peralatan untuk membuat ekstrak kulit buah manggis timbangan, oven, mesin penggiling, bejana tertutup, rotary evaporator
g. Timbangan tikus, gelas arloji, bak bedah dan dissecting set, cawan petri, batang pengaduk, sarung tangan, masker, kertas milli.
h. Mikroskop binokuler
3.9. Etika Penelitian
Penggunaan dan penanganan hewan di laboratorium penelitian dilakukan sesuai dengan aturan etika penelitian hewan yang diatur dalam deklarasi Helsinki
dan Ethical clearance diperoleh dari komite etik Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam FMIPA USU Medan.
3.10 Pelaksanaan penelitian 3.10.1 Persiapan dan pemeliharaan hewan percobaan
Mencit dipelihara dalam kandang plastik ukuran 30 x 20 x 10 cm dengan anyaman kawat sebagai penutup, dasar kandang dilapisi sekam padi setebal 0,5-1
cm dan diganti setiap tiga hari, ditempatkan dalam ruangan yang memiliki ventilasi dan mendapat cahaya matahari secara tidak langsung. Kandang tempat
makan dan minum dibersihkan minimal tiga kali dalam seminggu. Sebelum perlakuan, mencit diaklimatisasi selama seminggu. Pemberian minum dilakukan
Universitas Sumatera Utara
setiap hari secara ad libitum dan pakan yang diberikan berupa pellet c-0,5 produksi PT. Chaeron Pokphan Medan. Cahaya ruangan, kelembaban ruangan dan
suhu berada pada kisaran alamiah. Sampel yang terdiri dari 25 mencit dibagi secara acak dalam lima kelompok, masing-masing kelompok lima ekor. Tiap
kelompok diberi kode kelompok I, II, III, IV dan V. Perlakuan diberikan sesuai dengan kelompok. Sebelum perlakuan, lebih
dulu dilakukan penimbangan berat badan tikus. Pakan diberikan setelah perlakuan dilakukan berupa pelet dicampur jagung halus dengan perbandingan 2 : 1
diberikan secara setiap pagi hari jam ± 10.00-11.00 WIB sebanyak 2,5-5 grharimencit serta air minum ad libitum dari Perusahaan Air Minum PAM.
Tabel 3.1. Dosis pemberian Ekstrak etanol kulit manggis pada kelompok perlakuan
Kelompok Dosis Ekstrak etanol kulit manggis
I P0 Kontrol
II P1 III P2
IV P3 V P4
Kontrol MSG 8mgg bb MSG + Ekstrak Manggis 600mg kg bb
MSG + Vitamin E 0,2mgg bb Ekstrak Manggis 600mg kg bb
3.10.2 Prosedur pembedahan hewan mencit
Prosedur pembedahan dilakukan melalui tahap persiapan, pembedahan dan sanitasi. Pada tahap persiapan, disiapkan pot yang sudah diberi label sesuai
dengan nomor perlakuan mencit yang akan dilakukan pembedahan. Pot organ di isi dengan formalin buffer 10 untuk menyimpan organ. Disiapkan peralatan
Universitas Sumatera Utara
bedah seperti gunting bedah, pinset, gelas arloji, cawan petri, papan bedah, pins, beker glas.
Tahap pembedahan, mencit dikorbankan secara neck dislocation. Mencit diposisikan pada papan bedah menggunakan pins dan di bedah mulai dari bagian
perut menggunakan gunting bengkok. Organ ginjal diambil, dibersihkan dari kotoran yang menempel, dicuci dengan menggunakan NaCl 0,9 sampai bersih.
Secara makroskopik, ditimbang berat dan diamati perubahan warna, konsistensi dan permukaan pada ginjal, setelah itu dimasukkan kedalam pot berisi formalin
buffer 10. Tahap sanitasi dilakukan dengan cara memasukkan sisa organ mencit yang
tidak terpakai dalam kantong plastik yang akan dibuang. Tempat kerja sisa melakukan pembedahan dibersihkan dan semua peralatan bedah yang terpakai
dibersihkan.
3.10.3 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Buah Manggis
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah kulit buah manggis yang di peroleh dari perkebunan penduduk daerah Pantai Gemi, Stabat, Sumatera
Utara. Kulit buah dibersihkan dari pengotor lalu dicuci hingga bersih, dikupas kulit buah terluar dan ditimbang, diperoleh berat pericarp sebesar 10 kg.
Selanjutnya kulit buah tersebut dikeringkan selama 7 hari dalam lemari pengering dengan temperatur 40
o
C sampai kulit buah kering, didapat berat kering 2454,7 gram. Simplisia yang telah kering dihaluskan menjadi serbuk lalu dimasukkan ke
dalam wadah plastik bertutup dan di simpan pada suhu kamar. Kemudian serbuk ditimbang. Diperoleh berat kering sebesar 2262,8 gram.
Universitas Sumatera Utara
Sebanyak 2262,8 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana tertutup rapat dan dibasahi dengan etanol 96 sampai semua serbuk terendam,
biarkan selama lima hari sambil diaduk 3-4 kali sehari. Setelah itu massa dipindahkan kedalam corong dan disaring menggunakan kertas penyaring. Hasil
penyaringan yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator. Diperoleh ekstrak kental sebanyak 700 gram BPOM, 2010.
3.10.4 Prosedur pembuatan preparat histologi ginjal mencit
Sampel jaringan ginjal mencit diambil dan dicuci dengan NaCl fisiologis, kemudian difiksasi dengan larutan formalin buffer 10 0,1 molL Phospat Buffer
saline PH 7, selama 6-48 jam. Kemudian dilakukan dehidrasi dengan menggunakan alkohol 70, 80, 96, dan alkohol absolut masing-masing 1 jam
untuk pengeluaran air dari jaringan tersebut. Clearing atau penjernihan menggunakan xylol 1, 2 dan 3 selama 1 jam setelah itu dilakukan Impregnasi
penyusupan parafin dengan parafin cair 1 dan 2 suhu 60-70
o
C masing-masing selama 2 jam. Pada penelitian ini menggunakan mesin tissue prosescing otomatis
dengan merk Leica TP 1020. Embedding parafinisasi yaitu pembuatan blok parafin dengan cara
penanaman jaringan dalam kaset dan didinginkan, kemudian dilakukan proses sectioning pemotongan, dengan menggunakan mikrotom setebal 5µm dan
selanjutnya dimasukkan ke dalam wadah penampung atau waterbath. Kemudian dilanjutkan dengan proses mounting dengan meletakkan sediaan di atas objek glas
dan diolesi dengan glyserin. Proses terakhir adalah staining atau pewarnaan dengan hematoksilin eosin, tutup objek glas dengan menggunakan deck glass dan
Universitas Sumatera Utara
entelan, kemudian diamati di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran mulai dari 40x, 100x dan 400x.
3.10.5 Prosedur pewarnaan Hematoxylin Eosin
Blok sediaan preparat yang telah diparafinisasi dicelupkan kedalam cairan xylol yang ke 1, kemudian dicelupkan lagi kedalam larutan xylol ke 2 dan terakhir
kedalam larutan xylol yang ke 3 masing-masing selama 1 menit. Kemudian dilakukan rehidrasi dengan alkohol absolut, alkohol 96, alkohol 80, dan
alkohol 50 masing-masing 1 menit, kemudian dicuci dibawah air mengalir selama 1 menit dan dicelupkan kedalam larutan Mayer’s Hematoxylin selama 5
menit, bilas dengan air mengalir selama 30 detik, kembali dicelupkan kedalam larutan acid alkohol 1 : 15-30 detik, cuci kembali dengan air mengalir selama 2
menit kemudian blok sediaan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan agar tidak ada lagi sisa dari air, setalah itu dilakukan pewarnaan eosin selama 2-3
menit kembali dicuci dibawah air mengalir selama 30-60 detik. Kembali dicelupkan kedalam alkohol 95 dan alkohol absolut lebih kurang sebanyak 10
kali celupan, kemudian dicelupkan lagi kedalam xylol I selama 1 menit dan xylol II selama 2 menit. Tetesi cairan permount dan tutup dengan deck glass dan
entelan, proses terakhir adalah blok sediaan diamati dibawah mikroskop cahaya merk Olympus CX21.
3.10.6 Prosedur Pewarnaan Immunohistokimia
Dilakukan deparafinisasi slide memakai larutan Xylol 1, 2 dan 3 masing- masing selama 5 menit, kemudian dilakukan proses rehidrasi utk menghilangkan
Universitas Sumatera Utara
sisa xylol dengan menggunakan larutan alkohol absolut, alkohol 96, alkohol 80, dan alkohol 70 masing-masing selama 4 menit, kemudian dicuci di bawah
air mengalir selama 5 menit. Masukkan slide ke dalam mesin pengering merk PT. Link Dako Epitope Retrieval, kemudian diatur set up Preheat 65
o
C, running time 98
o
C selama 15 menit, tunggu sampai ± 1 jam, setelah slide kering, dengan menggunakan spidol pap pen, preparat yang ada di slide dilingkari agar pada saat
penetesan antibodi atau cairan lainnya tidak keluar melewati batas lingkaran pap pen tadi. Segera masukkan slide kedalam larutan Tris Buffered Saline TBS pH
7,4 selama 5 menit, kemudian dilakukan blocking dengan peroxidase, selama 5- 10 menit, kemudian kembali dicuci dalam larutan Tris Buffered Saline TBS pH
7,4 selama 5 menit blocking kembali dengan Normal horse serum NSH 3, selama 15 menit, cuci dalam larutan Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 selama 5
menit. Setelah itu di inkubasi menggunakan SOD-1 polyclonal Antibody 3458- 100, PT. Bio Vision, pengenceran 1:50 masing-masing selama 1 jam. Cuci
kembali kedalam larutan Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 atau Tween 20 selama 5 menit, kemudian tetesi dengan antibodi sekunder merk Dako Real Envision
RabbitMouse selama 30 menit. Setelah itu slide kembali dicuci dalam larutan Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 atau Tween 20 selama 5-10 menit. Kemudian slide
ditetesi dengan DAB + Substrat Chromogen solution dengan pengenceran 20µL DAB : 1000 µL substrat tahan 5 hari di suhu 2-8
o
C setalah dicampur selama 5 menit, di cuci kembali dengan air mengalir dan dilakukan counterstain dengan
Hematoxylin masing-masing selama 10 menit. Cuci dibawah air mengalir selama 5 menit, celupkan slide preparat kedalam lithium carbonat 5 dalam aqua
Universitas Sumatera Utara
selama 2 menit, cuci dengan air mengalir dan kembali dilakukan proses pengeringan cairan sebelumnya dengan proses dehidrasi menggunakan alkohol
80, alkohol 96, alkohol Absolut masing-masing selama 5 menit, kemudian clearing dengan larutan Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3 masing-masing selama 5 menit,
kemudian mounting dan tutup slide preparat dengan cover glass dan preparat siap dilihat.
3.12 Analisis Data
Semua data dipresentasikan dalam bentuk rata-rata simpang baku rata- rata ± SD. Dilakukan uji normalitas dan homogenitas data. Jika data berdistribusi
normal dan homogen dilakukan uji ANOVA. Bila terdapat perbedaan nyata dilanjutkan dengan uji Post Hoc analisa Benferroni taraf 5 untuk melihat
perbedaan antara kelompok kontrol dari masing-masing perlakuan. Jika distribusi data tidak normal dan tidak homogen dilakukan transformasi data. Kemudian diuji
lagi normalitas dan homogenitas data. Apabila masih tidak normal distribusinya dan data tidak homogen maka diuji Mann Whitney untuk membandingkan antara
2 kelompok perlakuan kontrol vs perlakuan. Pada kelompok data lebih dari 2 kelompok maka dilakukan uji Friedman.
Semua analisis data dilakukan dengan menggunakan SPSS versi 18,0. Dalam penelitian ini, hanya rata-
rata perbedaan p ≤ 0.05 yang dianggap bermakna signifikan.
Universitas Sumatera Utara
68
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan didapatkan hasil pemeriksaan makroskopis berupa berat, warna dan konsistensi ginjal, pemeriksaan
mikroskopis meliputi kerusakan sel ginjal dan tampilan immunohistokimia antioksidan endogen Cu Zn SOD pada ginjal.
4.1. Pemeriksaan makroskopis ginjal
Kategori