b. Media luria agar LA skim 2
Sebanyak 0,5 gram ekstrak khamir, 1 gram NaCl, 1 gram tryptone dan 3,5 bv agar dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan
akuades sampai tanda tera 70 ml, lalu dihomogenkan media agar. Sedangkan untuk skim, sebanyak 2 gram skim dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan
ditambahkan akuades sampai menunjukkan tanda tera 30 ml, kemudian dihomogenkan. Secara terpisah, media agar dan skim disterilisasi suhu 121
o
C selama 15 menit. Selanjutnya didinginkan hingga suhu 40
o
C, kemudian kedua media tersebut dicampurkan hingga homogen.
2. Penyegaran bakteri uji
Penyegaran bakteri bertujuan untuk meregulasi pertumbuhan sel bakteri pada media yang baru sehingga diperoleh isolat bakteri dengan kondisi
pertumbuhan yang optimum. Bakteri uji yang akan disegarkan diambil satu ose, lalu digoreskan pada media agar miring yang baru lalu diinkubasi selama 24 jam.
3. Penentuan indeks proteolitik modifikasi Febrian 2004
Tujuan uji ini adalah untuk mendapatkan bakteri yang potensial menghasilkan enzim protease. Uji ini dilakukan dengan cara penapisan
menggunakan media Luria Agar LA skim 2 bv. Cawan petri disiapkan dan diberi tanda untuk memisahkan atau membatasi penapisan setiap bakteri dengan
membuat garis diagonal sehingga terdapat empat kuadran. Sebanyak 10 ml media LA skim 2 bv dituangkan ke dalam cawan petri, lalu didiamkan hingga beku.
Masing-masing bakteri uji ditotolkan pada media menggunakan tusuk gigi yang terlebih dahulu telah disterilisasi. Media diinkubasi selama 24 jam hingga
terbentuk zona bening. Zona bening yang terbentuk menunjukkan aktivitas protease dari masing-
masing bakteri uji yang mampu mendegradasi skim dalam media LA. Diameter zona bening diukur dengan jangka sorong, kemudian dihitung indeks proteolitik
masing-masing bakteri.
Indeks Proteolitik IP = mm
koloni diameter
mm bening
zona diameter
3.3.4. Penapisan inhibitor protease dari ekstrak karang lunak
Media yang digunakan untuk penapisan ini adalah LA skim 2 bv. Penapisan ini berfungsi untuk mendapatkan ekstrak karang lunak yang potensial
sebagai inhibitor protease. Ekstrak masing-masing dari jenis karang lunak yang berbeda dilarutkan
kembali dengan pelarutnya, yaitu metanol, etil asetat dan heksana dengan konsentrasi 10 bv. Selanjutnya sebanyak 200 µl larutan tersebut ditambahkan
ke dalam cawan petri, kemudian dicampur dengan 10 ml LA skim 2 dan digoyang-goyang hingga ekstrak tercampur merata, lalu media didiamkan hingga
beku. Untuk kontrol digunakan pelarutnya, yaitu metanol, etil asetat dan heksana sebanyak 200 µl dicampur dengan LA skim 2 .
Sebanyak satu ose bakteri patogen ditusukkan ke dalam media. Setiap cawan ditusukkan 4 jenis bakteri uji secara duplo, lalu di inkubasi selama 24 jam
dengan suhu 37
o
C. Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter zona bening yang
dihasilkan oleh masing-masing bakteri uji. Untuk menghitung potensi daya hambat dari masing-masing ekstrak digunakan rumus :
Potensi Daya Hambat = 100
1 x
IP IP
k e
⎥ ⎦
⎤ ⎢
⎣ ⎡
⎥ ⎦
⎤ ⎢
⎣ ⎡
−
Keterangan :
IP
e
: Indeks proteolitik bakteri uji pada media mengandung ekstrak
IP
k
: Indeks proteolitik bakteri uji pada media kontrol Ekstrak karang lunak yang memiliki potensi penghambatan lebih dari
50 dilanjutkan untuk pengujian minimum inhibitory concentration MIC.
3.3.5. Minimum Inhibitory Concentration MIC modifikasi Parish dan
Davidson 1993 Metode yang digunakan adalah metode sumuran. Sebelum metode ini
dilakukan, terlebih dahulu dilakukan prekultur bakteri uji dengan cara mengambil biakan bakteri patogen sebanyak satu ose dan dimasukkan ke dalam media LB.
Kemudian diinkubasi dengan suhu 37
o
C selama 24 jam dan diukur OD optical
density menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 620 nm. Prekultur ini dilakukan untuk mendapatkan bakteri uji dengan nilai OD = 0,5.
Selanjutnya masing-masing
ekstrak karang lunak diencerkan dengan
pelarutnya bv, sebagai kontrol negatif digunakan pelarutnya dan kontrol positif digunakan EDTA yang dilarutkan dalam buffer Tris-HCl 0,2 M, pH 8.
Pengenceran ekstrak karang lunak dengan LA skim 2 disajikan pada Tabel 5. Setiap cawan diisi dengan 10 ml media LA skim 2 dengan suhu
±40
o
C, kemudian 200 µl larutan ekstrak karang lunak dan larutan EDTA dari tiap-tiap
konsentrasi dimasukkan ke dalam cawan. Campuran media digoyang-goyang hingga homogen, lalu didiamkan hingga membeku. Setelah membeku setiap
cawan dibuat sumur dengan diameter 6 mm sebanyak 4 buah. Suspensi bakteri prekultur dengan nilai OD=0,5 dipipet sebanyak 2 µl ke dalam sumur, lalu
diinkubasi media selama 24 jam dengan suhu 37
o
C, kemudian dihitung aktivitas penghambatan protease. Nilai MIC diperoleh dengan menentukan konsentrasi
minimum yang mampu menghambat aktivitas protease bakteri patogen lebih dari 99 .
Tabel 5. Pengenceran ekstrak karang lunak dengan media LA skim 2
Ekstrak karang lunak Konsentrasi ekstrak
karang lunak dalam media agar
EDTA Konsentrasi EDTA
dalam media agar 10 0,2 10 0,2
8 0,16 8 0,16 6 0,12 6 0,12
4 0,08 4 0,08 2 0,04 2 0,04
Kontrol pelarut Kontrol Buffer Tris-
HCL 0,2 M pH 8 Catatan : konsentrasi ekstrak disesuaikan dengan daya hambat yang diperoleh
3.3.6. Analisis Data
Berdasarkan hasil pengamatan yang berupa pengukuran diameter zona bening dan diameter koloni dari tiap-tiap jenis bakteri uji diolah menggunakan
program Microsoft Excell 2003 untuk mengetahui persentase penghambatan dari masing-masing Karang lunak. Selanjutnya data diolah secara deskriptif.
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori