Proses Biodegradasi Diazinon Fiksasi, sebelum bakteri diwarnai terlebih dahulu dilakukan fiksasi dengan

ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, dan 1707 ppm dengan jumlah kompos dalam tanah 6, 10, 20, 30 dan 35. 2. Analisis kompos SMC yang meliputi: TPC, CN, KTK, unsur hara, kadar air, kadar abu, pH, aktivitas mikroba, dan kadar pestisida. 3. Pencampuran kompos dengan tanah yang telah dicemari diazinon. 4. Fermentasiinkubasi pada suhu ruang dengan kadar air bahan 30-60 selama 28 hari. 5. Analisis hasil fermentasiinkubasi kadar diazinon, TPC, CN, KTK, unsur hara, kadar air, kadar abu, pH, dan aktivitas mikroba. Gambar 3 Diagram tahapan penelitian

3.5. Proses Biodegradasi Diazinon

Sampel tanah yang belum dicemari dengan diazinon terlebih dahulu disterilisasi pada suhu 120 o C dalam autoklaf selama 15 menit setelah dingin tanah dicemari dengan pestisida organofosfat merk diazinon 60EC, kemudian tanah tersebut dicampur dengan kompos dengan perbandingan tertentu. Sebelum Sterilisasi tanah Pencampuran Analisis Kompos CN, KTK, unsur hara, Kadar air, kadar abu, pH, kadar pestisida, TPC, aktivitas mikroba Sampling: satu kali seminggu untuk analisis penurunan kadar diazinon, TPC, aktivitas mikroba Fermentasiinkubasi T = suhu ruang Kadar air bahan = 30-60 Waktu = 28 hari Isolasi Mikroba bakteri kapang Identifikasi bakteri Analisis: kadar diazinon, TPC, CN,KTK, unsur hara, kadar air, kadar abu, pH, dan aktivitas mikroba. Uji kemampuan degradasi diazinon Diazinon EC 60 Kompos limbah media jamur Tanah kompos dicampur dengan tanah, terlebih dahulu dilakukan pengujian mutu kompos tersebut. Parameter yang diuji adalah CN, unsur hara, KTK, kadar air, kadar abu, pH, TPC, aktivitas mikroba, dan kadar pestisida. Campuran tersebut kemudian diaduk hingga homogen lalu diinkubasi selama 28 hari dengan kadar air bahan 30-60 pada suhu kamar 28-32 o C dan pH 7-8. Selama proses inkubasi berlangsung sampel ditutup dengan plastik untuk mengurangi terjadinya penguapan dan tidak terkena cahaya. Sampel diambil satu kali seminggu di lima titik dengan dua kali pengambilan kemudian digabung menjadi satu dan diaduk hingga homogen sistem komposit kemudian dianalisis penurunan kadar diazinonnya. Pada akhir proses inkubasi, selain analisis penurunan kadar diazinon juga dilakukan pengujian CN, KTK, unsur hara, kadar abu, kadar air, pH, TPC, dan aktivitas mikroba.

3.6. Analisis Kadar Diazinon

Analisis kadar diazinon menggunakan metode seperti yang dilakukan oleh Ningsih 2001 yaitu menggunakan kromatografi lapis tipis KLT menggunakan plat silika gel 60 F 254 dan spektrofotometer UVVIS Beckman DU 650 pada panjang gelombang 241 nm.

3.6.1. Kromatografi Lapis Tipis KLT

Kromatografi Lapis Tipis adalah metode pemisahan fisikokimia yang lapisan pemisahan terdiri atas bahan berbutir-butir fase diam dan ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas logam atau lapisan yang cocok, campuran yang akan dipisahkan berupa larutan. Larutan ditotolkan berupa bercak, kemudian plat diletakkan dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok fase gerak yang telah dijenuhkan. Pemisahan terjadi selama perambatan fase gerak. Derajat retensi pada KLT dinyatakan sebagai “Retention Factor” Rf yang dinyatakan dengan rumus sebagai berikut: Jarak titik pusat bercak dari titik awal Rf = …………………….1 Jarak garis depan dari titik awal Metode ini dilakukan dengan maksud untuk mengetahui adanya atau tidaknya produk turunan hasil degradasi diazinon dalam sampel. Analisis kadar diazinon dengan metode KLT ini menggunakan plat silika gel 60 F 254 , eluen pengembang heksana:etilasetat dengan perbandingan 10:1 vv dan pewarna digunakan serium II sulfat. KLT dilakukan dengan cara mentotolkan sampel pada plat kemudian dimasukkan kedalam bejana yang berisi heksana dan etyl asetat dengan perbandingan 10:1 vv yang telah dijenuhkan selama 30 menit. Lalu didiamkan hingga eluen naik sampai batas garis. Spot yang terbentuk dapat dilihat dengan menggunakan sinar ultraviolet dan pewarnaan dengan menggunakan serium II sulfat.

3.6.2. Spektrofotometer UV-VIS

Spektrofotometri adalah suatu metode pengukuran serapan radiasi elektromegnetik pada panjang gelombang tertentu yang sempit dan mendekati monokromatik dan diserap oleh zat. Pelarut yang sering digunakan adalah air, metanol, n-heksana, etanol, minyak bumi, dan eter. Analisis diazinon dengan metode spektrofometri ini merupakan modifikasi yang dilakukan oleh Bavcon et al. 2003 dengan metode yang dilakukan oleh Ningsih 2001, yaitu dilakukan dengan cara mengekstraksi sebanyak 10 gram sampel dengan etil asetat sebanyak 20 ml. Larutan yang diperoleh diuapkan kemudian dilarutkan kembali dengan 2 ml metanol p.a, sampel disonifikasi agar larutan tersebut tercampur dengan baik homogen. Kemudian dilakukan pembacaan pada spektrofotometer UV-VIS Beckman DU 650 dengan sinar UV pada panjang gelombang 241 nm. Absorbansi yang diperoleh kemudian diplot pada kurva standar untuk menghitung konsentrasi diazinon dalam sampel. 3.7. Isolasi Mikroba dan Identifikasi bakteri 3.7.1. Pembuatan Media 3.7.1.1. Potato Dekstrose Agar PDA. Media ini digunakan untuk menginokulasi kapang dari SMC. Cara pembuatan: 1. Ditimbang PDA sebanyak 3.9 g dan agar powder 0.5 g. 2. Kedua bahan tersebut dicampur dan ditambahkan dengan aquadest sebanyak 100 ml, kemudian dipanaskan sambil diaduk. 3. Setelah mendidih dan homogen media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. 4. Media didinginkan hangat kuku lalu ditambahkan khloramphenikol 50 ppm sebanyak 1 ml yang telah disterilkan dengan millipore 0.45 μm. 5. Media dituang ke dalam petri steril ± 1-2 ml, dan didinginkan 6. Setelah padat petri ditutup dan dibalik agar uap air tidak jatuh ke atas permukaan agar. 3.7.1.2. Nutrien Agar NA Media ini digunakan untuk menginokulasi bakteri dari SMC. Cara pembuatan: 1. Ditimbang NA sebanyak 2.3 g dan agar powder 0.5 g. 2. Kedua bahan tersebut dicampur dan ditambahkan dengan aquadest sebanyak 100 ml, kemudian dipanaskan sambil diaduk. 3. Setelah mendidih dan homogen media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. 4. Media didinginkan hangat kuku lalu ditambahkan nistatyn 50 ppm sebanyak 1 ml yang telah disterilkan dengan millipore 0.45 μm. 5. Media dituang ke dalam petri steril ± 1-2 ml, dan didinginkan 6. Setelah padat petri ditutup dan dibalik agar uap air tidak jatuh ke atas permukaan agar.

3.7.2. Isolasi Mikroba Bakteri dan Kapang

Mikroba yang terdapat dalam SMC masih merupakan koloni campuran sehingga perlu dilakukan isolasi untuk mendapatkan isolatbiakan murni koloni tunggal. Isolasi mikroba dapat dilakukan dengan dua cara yaitu : 1. Metode Cawan TuangTaburan Puor Plate Method Metode ini dilakukan dengan cara menggoreskan suspensi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan medium agar yang sesuai dalam cawan petri. Setelah diinkubasi pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni yang terpisah yang mungkin berasal dari satu sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut. Metode goresan ini dapat dilakukan dengan metode goresan lurus, kuadran, atau radian. 2. Metode Cawan Gores Streak Plate Method Metode dilakukan dengan cara menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 50 o C dengan suspensi bahan yang mengandung bakteri dan menuangkannya ke dalam cawan petri, setelah diinkubasi akan terlihat koloni- koloni yang tersebar di permukaan agar. Dalam penelitian ini isolasi mikroba dilakukan dengan metode cawan tuanggores yaitu dengan menginokulasi SMC pada media padat Nutrient Agar NA dan Potato Dekstrose Agar PDA. Pada media padat NA ditambahkan zat antibiotik nistatyn yang berfungsi untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme kapang dan khamir sedangkan pada media padat PDA ditambahkan dengan khloramphenikol untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Inokulasi mikroba ini dilakukan dengan dua metode yaitu cair dan padat: 1. Menimbang SMC sebanyak 1gram lalu di larutkan dengan air steril sebanyak 10 ml kemudian di goyang shaker selama 30 menit, supernatan yang diperoleh dipipet sebanyak 100 μl lalu dituang kedalam cawan petri yang berisi media PDA dan NA 2. Ditimbang kompos sebanyak 5 gram lalu ditabur kedalam cawan petri yang yang berisi media PDA dan NA. Masing-masing cawan petri diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu kamar selama 24-48 jam. Bakteri dan kapang yang tumbuh dipindahkan pada media padat lain untuk memperoleh biakan murni. Setelah 2-3 hari isolat yang tumbuh pada media awal dipindahkan dan dipisahkan berdasarkan perbedaan bentuk dan morfologinya ke media padat NA dan PDA lainnya yang tidak mengandung nistatyn dan khloramphenikol. Isolat-isolat tersebut dipindahkan dengan menggunakan jarum ose kemudian menggoreskannya pada media padat untuk memisahkan isolat-isolat tersebut agar diperoleh koloni tunggal single coloni. Koloni tersebut diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang. Hal ini dilakukan berulang-ulang hingga diperoleh isolat yang murni. Isolat yang telah murni dipindahkan ke dalam media agar miring NA dan PDA dengan cara membuat garis zig zag. Kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang lalu disimpan dalam lemari pendingin.

3.7.3. Pewarnaan bakteri

Pewarnaan bakteri dimaksudkan untuk melihat struktur sel bakteri dengan seksama. Fungsi pewarnaan bakteri terutama memberi warna pada sel dan bagian-bagiannya agar lebih kontras dan tampak lebih jelas, sehingga dapat diamati berbagai bentuk morfologi, jenis gram positif atau gram negatif, susunan bakteri, serta sel-sel bakteri spora, kapsel, atau flagela. Sel-sel bakteri yang tidak diwarnai pada umumnya sukar diamati dengan mikroskop cahaya biasa, karena sitoplasma sel mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya Lay 1992. Hasil pewarnaan sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu:

a. Fiksasi, sebelum bakteri diwarnai terlebih dahulu dilakukan fiksasi dengan

menggunakan cara fisik pemanasan atau dengan freeze drying ataupun menggunakan agen kimia asam pikrat, alkohol, aseton, asam kromat-asam osmiat. Fiksasi berfungsi untuk 1 Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel; 2 Mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan karboksilat, amino primer, sulfihidril; 3 Merubah afinitas pewarna bakteri; 4 Mencegah terjadinya otolisis sel; 5 Dapat membunuh bakteri secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan-perubahan bentuk atau strukturnya; 6 Melekatkan bakteri di atas gelas benda; 7 Membuat sel lebih kuat keras.

b. Substrat, tiap pewarna asam maupun basa dapat bereaksi dengan konstituen