26
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian aktivitas antioksidan pada cabai rawit putih ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena adanya perlakuan terhadap subyek uji dan
menggunakan rancangan deskriptif.
B. Variabel
1. Variabel bebas pada penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak etanol cabai
rawit putih.
2. Variabel tergantung pada penelitian ini adalah aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH IC dan kadar kapsaisin dalam ekstrak etanol cabai rawit
putih.
3. Variabel pengacau terkendali pada penelitian ini adalah lokasi pengambilan sampel, umur tanaman, bobot sampel tanaman yang digunakan, dan waktu
pemanenan.
4. Variabel pengacau tak terkendali pada penelitian ini adalah cuaca, curah
hujan, cahaya matahari, dan kelembaban ruangan.
C. Definisi Operasional
1. Cabai rawit putih adalah buah yang belum masak dari tanaman cabai rawit Capsicum frutescens L. yang didapat dari Pasar Beringharjo, Yogyakarta.
2. Ekstrak etanol buah cabai rawit putih adalah ekstrak kental yang didapat dari penyarian buah cabai rawit putih dengan alat Soxhlet menggunakan pelarut
etanol. 3. Metode DPPH adalah metode pengujian aktivitas antioksidan dalam
menangkap radikal bebas DPPH 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil. Reaksi DPPH dengan senyawa antioksidan dapat menyebabkan perubahan intensitas warna
sehingga absorbansi menurun. 4. Persen inhibition concentration IC adalah persen yang menyatakan
kemampuan ekstrak etanol cabai rawit putih dalam menangkap radikal bebas DPPH.
5. Inhibition concentration 50 IC
50
merupakan nilai konsentrasi ekstrak etanol cabai rawit putih yang dapat menangkap 50 radikal bebas DPPH.
D. Bahan dan Alat Penelitian
1. Bahan penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini, yaitu cabai rawit putih Capsicum frutescens L. yang didapat dari pasar Beringharjo, Yogyakarta,
bahan kimia farmasetis berupa aquadest, bahan kualitas teknis berupa etanol 96 Bratachem, bahan kualitas pro analitik meliputi etanol 96 E.Merck,
kapsaisin Sigma-Aldrich, metanol E.Merck, kloroform E.Merck, toluena
E.Merck, aseton E.Merck, DPPH Sigma-Aldrich, silica gel 60 F
254
dan aluminium foil.
2. Alat penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini, yaitu vortex, spektrofotometer UV-VIS Shimadzu, blender, corong Buchner, oven,
mikropipet 10 – 1000 µL; 1 – 10 mL Socorex, neraca analitik Ohaus,
vacuum rotary evaporator Junke Kunkel, waterbath Memmet,
densitometer Shimadzu, tabung reaksi bertutup Schott, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis Pyrex dan Iwaki.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi buah
Determinasi buah cabai rawit putih yang digunakan berdasarkan pengamatan morfologinya dilakukan dengan membandingkan literatur dari
Bosland, Bailey, Iglesias-Olivas 1996.
2. Pengumpulan bahan
Buah cabai rawit putih diperoleh dari Pasar Beringharjo, Yogyakarta.
3. Pembuatan ekstrak buah cabai rawit putih
Buah cabai rawit putih sebanyak 1 kg yang masih segar dibersihkan dan dicuci kemudian dibuang bagian tangkainya. Buah cabai rawit putih
dikeringkan pada oven dengan suhu 50 C, kemudian dihaluskan dengan
blender . Simplisia yang telah halus ditimbang sebanyak 25,0 g, dibungkus
menggunakan kertas saring. Simplisia dimasukkan dalam labu alas bulat berisi 350,0 mL etanol p.a. Soxheltasi dilakukan pada suhu 70
C selama 8 jam sampai didapat hasil ekstrasi yang jernih. Filtrat hasil ekstraksi
dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator.
4. Penentuan aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
a. Pembuatan larutan DPPH, sebanyak 15,80 mg serbuk DPPH dilarutkan dengan 100,0 mL etanol p.a hingga diperoleh larutan DPPH dengan
konsentrasi 0,4 mM. Larutan DPPH ditutup dengan aluminium foil dan harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan stok kapsaisin, sebanyak 2,50 mg kapsaisin dimasukkan dalam labu ukur 10 mL, kemudian dilarutkan etanol p.a
hingga batas.
c. Pembuatan larutan seri baku kapsaisin, diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 mL larutan stok kapsaisin, kemudian ditambahkan etanol p.a
sampai 10,0 mL sehingga diperoleh larutan baku kapsaisin sebesar 25; 50; 75; 100; dan 125 µgmL.
d. Pembuatan larutan uji, sejumlah 25,0 mg ekstrak buah cabai rawit putih ditimbang kemudian ditambahkan etanol p.a sampai 25,0 mL. Dari
larutan tersebut diambil 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 dan 5,0 mL kemudian ditambah etanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh larutan uji dengan
konsentrasi 100; 200; 300; 400 dan 500 µgmL. e. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan, sebanyak 1,0 mL larutan DPPH
dimasukkan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi. Masing-masing tabung reaksi ditambahkan 1,0 mL etanol p.a, larutan baku kapsaisin 75
µgmL, dan larutan uji 300 µgmL. Kemudian ditambahkan 3,0 mL etanol p.a pada masing-masing larutan. Larutan divortex selama 30 detik.
Setelah 30 menit, perubahan warna yang terjadi diamati. f. Penentuan panjang gelombang maksimum, pada 3 labu ukur 10 mL,
dimasukkan masing-masing 0,50; 1,0; dan 1,50 mL larutan DPPH. Larutan ditambahkan dengan etanol p.a hingga tanda batas sehingga
konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080 mM. Larutan divortex selama 30 detik. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang
serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400
– 600 nm.
g. Penentuan operating time OT, sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga labu ukur 5 mL, ditambahkan
masing-masing dengan 1,0 mL larutan baku kapsaisin 25; 75; dan 125 µgmL. Kemudian larutan ditambahkan dengan etanol p.a hingga tanda
batas. Larutan tersebut divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca
absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang
517 nm setiap 5 menit selama 1 jam. h. Penentuan aktivitas antioksidan buah cabai rawit putih,
i. Pengukuran absorbansi larutan DPPH kontrol, pada labu ukur 5 mL, dimasukkan sebanyak 1,0 mL larutan DPPH. Larutan
ditambahkan dengan etanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang
gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan baku
dan larutan uji. ii. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan larutan uji,
sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL kemudian ditambah dengan 1,0 mL larutan pembanding dan
larutan uji pada berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat. Selanjutnya, larutan tersebut ditambah dengan etanol p.a hingga
tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan didiamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan tiga kali replikasi.
i. Validasi metode uji aktivitas antioksidan, hasil dari prosedur 4h i dan ii divalidasi akurasi recovery, presisi CV, spesifisitas spektra
kontrol, dan linearitas nilai r. konsentrasi standar kapsaisin terukur
konsentrasi standar kapsaisin teoritis
Standar e iasi S konsentrasi standar kapsaisin terukur rata rata konsentrasi standar kapsaisin terukur
j. Estimasi aktivitas antioksidan, hasil dari prosedur 4h i dan ii, dihitung nilai IC dan IC
50
untuk kapsaisin dan ekstrak buah cabai rawit putih.
5. Penentuan kadar kapsaisin
a. Pembuatan fase gerak, fase gerak yang digunakan pada penelitian ini dibuat dalam perbandingan, yaitu toluena - kloroform - aseton 45:25:30,
vvv. Fase gerak dituang dalam bejana kromatografi kemudian kertas saring dimasukkan dalam bejana yang berisi fase gerak. Bejana ditutup
rapat dan dibiarkan hingga seluruh kertas saring terbasahi oleh fase gerak.
b. Pembuatan larutan stok kapsaisin, baku kapsaisin ditimbang seksama 5,0 mg ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml,
kemudian dilarutkan dengan metanol sampai tanda batas sehingga diperoleh larutan stok kapsaisin 0,50 mgmL.
c. Pembuatan larutan seri baku kapsaisin, larutan stok kapsaisin 0,50 mgmL ditotolkan dengan volume 1,0; 2,0; 4,0; dan 8,0
L pada lempeng silika gel 60 F
254
sehingga diperoleh seri kapsaisin dengan jumlah 0,5; 1,0; 2,0; dan 4,0 µg.
d. Pembuatan larutan uji, sejumlah 50,0 mg ekstrak buah cabai rawit putih ditimbang seksama kemudian dilarutkan dengan metanol sebanyak 500,0
µL. Larutan tersebut divortex selama 10 menit dengan pemanasan di atas waterbath
pada suhu 60 C. Kemudian larutan disentrifugasi selama 2
menit dan disaring dengan ayakan mesh 60. Larutan uji dibuat replikasi sebanyak tiga kali.
e. Penetuan kadar kapsaisin buah cabai rawit putih, sebanyak 10,0 L
larutan uji ditotolkan pada lempeng silika gel 60 F
254
, kemudian dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan
fase gerak toluena - kloroform - aseton 45:25:30, vvv. Pengembangan dilakukan setinggi 10
cm, lempeng silika kemudian dikeluarkan dan ditunggu hingga kering. Bercak diamati di bawah lampu UV 254 nm
kemudian dianalisis dengan densitometer pada panjang gelombang maksimum. Bercak seri baku kapsaisin diukur AUC-nya dengan
densitometri pada panjang gelombang pengamatan yang telah diperoleh. Puncak kromatogram dan nilai AUC yang muncul diamati. Dengan
metode regresi linear, nilai seri kadar µgmL diplotkan terhadap nilai AUC masing-masing seri larutan baku sehingga diperoleh persamaan y =
bx + a dimana y merupakan nilai respon AUC, x merupakan konsentrasi senyawa baku, a adalah intersept, dan b adalah slope. Kadar
kapsaisin dalam sampel ditentukan berdasarkan persamaan kurva baku yang paling baik.
F. Analisis Hasil
Aktivitas penangkapan radikal dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
bsorbansi
larutan kontrol
– bsorbansi
larutan baku uji
bsorbansi
larutan kontrol
Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC
50
menggunakan persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun
larutan baku kapsaisin, sedangkan sumbu y adalah IC, Lalu dianalisis secara statistik untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan bermakna antara IC
50
larutan baku kapsaisin dan larutan uji. Uji kadar kapsaisin total dilakukan secara kromatografi lapis tipis. Nilai
kadar tersebut didapatkan dari analisis data kromatogram dengan menggunakan densitometer. Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan nilai Rf
sampel dengan nilai Rf baku. Analisis kuantitatif yang dilakukan berdasarkan data AUC dari baku sehingga diperoleh persamaan regresi linear y = bx + a yang
merupakan hubungan antara kadar dengan luas area yang dihasilkan. Data AUC sampel kemudian dimasukkan dalam persamaan regresi masing-masing baku
sebagai y sehingga diperoleh kadar kapsaisin dalam sampel.
35
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Determinasi Buah
Determinasi buah cabai rawit putih merupakan tindakan awal yang dilakukan dalam suatu penelitian yang menggunakan buah sebagai bahan uji.
Determinasi dilakukan untuk memastikan kebenaran identitas dari buah yang digunakan untuk penelitian dan menghindari adanya kesalahan pengambilan
sampel. Jaminan kebenaran sampel sangat penting karena pada buah cabai terdiri dari berbagai macam spesies dan varietas. Masing-masing spesies buah cabai
memiliki kandungan fitokimia yang berbeda. Determinasi buah dilakukan dengan membandingkan beberapa spesies dari Capsicum yang mengacu pada Bosland,
Bailey, Iglesias-Olivas 1996.
Gambar 4. Morfologi berbagai spesies Capsicum Bosland, Bailey, Iglesias- Olivas, 1996
Kategori