S = Standard deviasi gabungan antara sampel darah metode
konvensional dan sampel darah kertas saring, yaitu: 1311,55 x
1
– x
2
= selisih rerata yang bermakna
= 21,16 orang ~ 22 orang Besar sampel pada penelitian ini adalah 30 orang.
3.5 Cara Pengambilan Sampel Penelitian
Pengambilan sampel penelitian dilakukan dengan menggunakan metode consecutive sampling.
3.6 Identifikasi Variabel
3.6.1 Variabel bebas : Darah kapiler cuping telinga dengan kertas saring, darah vena mediana kubiti dengan kertas
saring, darah vena mediana kubiti metode konvensional .
3.6.2 Variabel terikat : Kadar antibodi IgM anti PGL-1
3.7 Kriteria Inklusi dan Eksklusi
3.7.1 Kriteria Inklusi A. Penderita kusta yang diagnosisnya ditegakkan apabila dijumpai
minimal salah satu dari tanda kardinal. B. Penderita kusta dengan usia di atas 14 tahun.
C. Bersedia ikut serta dalam penelitian dengan menandatangani informed consent.
2
1000 1,64 + 0,84 1311,55
Maka : n = 2
Universitas Sumatera Utara
3.7.2 Kriteria Eksklusi A. Terjadi kesulitan dalam pengambilan sampel darah pada daerah
cuping telinga.
3.8 Alat, Bahan dan Cara Kerja
3.8.1 Alat dan bahan untuk pengambilan sampel A. Sarung tangan.
B. Alat ikat pembendungan torniquet. C. Kapas alkohol 70.
D. Spuit disposible 3 cc. E. Vacutainer tabung pengumpul darah steril 5 cc.
F. Pisau toreh skalpel no.15. G. Kertas saring Whatman chromthography Gr.41.
H. Kertas label. I. Plastik klip.
J. Spidol. K. Tabung mikrokapiler hematocrite tube.
L. Microtube tabung mikro 1 ml yang berisi bahan pengawet NaNO
3
M. Plester luka. untuk sampel serum.
N. Satu buah freezer. O. Satu buah centrifuge dengan kecepatan 2000 rpm.
Universitas Sumatera Utara
P. Kotak pendingin untuk menyimpan serum pada saat transportasi ke laboratorium pusat.
Q. Dry ice. 3.8.2 Alat dan bahan untuk pemeriksaan serologi kusta dengan uji ELISA
A. Immunowash BIORAD model 1575. B. Microplate.
C. Mikropipet. D. Gunting kertas.
E. Vortek. F. Blocking buffer.
G. BioliseX-read. H.
Tabung Eppendorf 1,5 μl, 0,5 μl. I.
Kontak inkubasi J. Larutan buffer PBST phosphate buffer saline tween +0,05
tween 20 3.8.3 Cara Kerja
A. Penderita kusta Dilakukan pemeriksaan pada penderita kusta dengan mencari
tanda-tanda kardinal untuk menegakkan diagnosis dan menentukan klassifikasi menurut WHO 1988 ataupun
mendapatkan data sekunder yaitu dari data rekam medis pasien pada saat pertama kali datang berobat ke Rumah Sakit Kusta
Universitas Sumatera Utara
Pulau Sicanang Belawan dan Rumah Sakit Umum Pusat H. Adam Malik Medan.
B. Prosedur pengambilan sampel a. Pengambilan sampel darah dilakukan di Rumah Sakit Kusta
Pulau Sicanang Belawan dan Rumah Sakit Umum Pusat H. Adam Malik Medan. Cara pengambilan sampel darah
adalah sebagai berikut : Gunakan sarung tangan, ambil darah dari vena mediana kubiti pada lipat siku, lokasi
penusukan harus bebas dari luka dan bekas lukasikatrik, pasang ikatan pembendungan torniquet pada lengan atas
dan pasien diminta untuk mengepal dan membuka telapak tangan berulang kali agar vena jelas terlihat, kulit di atas
lokasi tusukan dibersihkan dengan alkohol 70, biarkan sampai kering, spuit disiapkan dengan memeriksa jarum
dan penutupnya, vena mediana kubiti ditusuk dengan posisi 45
dengan jarum menghadap keatas, darah dibiarkan mengalir kedalam jarum, pasien diminta untuk membuka
kepalan tangannya agar aliran darah bebas, kemudian darah dihisap sebanyak 3 cc, torniquet dilepas, lalu jarum ditarik,
darah yang masih keluar diisap dengan tabung mikrokapiler sampai tanda merah, tempat bekas penusukan ditekan
dengan kapas alkohol sampai tidak keluar darah lagi kemudian bekas tusukan ditutup dengan plester.
Universitas Sumatera Utara
b. Darah sebanyak 3 cc dimasukkan ke dalam vacutainer 5 cc dan diberi label kemudian disentrifugasi menggunakan
sentrifuge dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit untuk mendapatkan serum. Serum yang diperoleh kemudian
dimasukkan ke dalam microtube 1 cc yang berisi bahan pengawet NaNO
3
untuk penyimpanan serum dan diberi label, selanjutnya serum disimpan pada freezer dengan suhu
0--20 c. Sampel darah pada tabung mikrokapiler yang diambil dari
vena mediana kubiti tadi diteteskan pada kertas saring Whattman chromathography paper Gr.41 sampai terserap
merata membentuk bulatan, biarkan kering dengan alami pada suhu kamar kemudian masukkan ke dalam plastik klip
dan diberi label selanjutnya disimpan di dalam kotak dengan temperatur ruangan.
C.
d. Untuk sampel darah kapiler cuping telinga, daerah cuping telinga dibersihkan dengan alkohol 70, biarkan sampai
kering, jaringan kulit ditoreh dengan menggunakan skalpel no.15 sedalam 3-5 mm sepanjang lebih kurang 1 cm, darah
yang keluar diisap dengan tabung mikrokapiler sampai tanda merah, kemudian teteskan darah pada kertas saring
Whattman chromathography paper Gr.41 sampai terserap merata membentuk bulatan, biarkan kering dengan alami
Universitas Sumatera Utara
pada suhu kamar kemudian dimasukkan ke dalam plastik klip dan diberi label selanjutnya disimpan di dalam kotak
dengan temperatur ruangan. C. Prosedur pengiriman sampel
Masing-masing sampel selanjutnya dibawa ke Tropical Disease Center yang berlokasi di
Jalan Mulyorejo, Kampus C Universitas Airlangga Surabaya
D. Prosedur pemeriksaan serologi uji ELISA . Sampel darah cuping telinga
dan vena mediana kubiti dengan kertas saring dibawa dengan menggunakan kotak biasa sedangkan sampel darah vena
mediana kubiti dengan metode konvensional dibawa dengan menggunakan kotak pendingin berisi dry ice.
a. Kertas saring yang mengandung darah dipotong kecil-kecil. b. Dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan ditambahkan
800 μl larutan PBST + NaN
3
c. Dilakukan vortex selama 5 menit untuk melarutkan serum. 20 pengenceran 10 kali.
d. Masukkan 50 μl coating buffer pH 9,6 PBS dan antigen
NT-P-BSA working solution ke dalam mikroplat yang telah dibagi sesuai skema dan diinkubasi pada suhu 37
e. Mikroplat dicuci dengan washing buffer larutan PBST sebanyak 3 kali dengan alat BioRad Immunowash model
1575. C selama
1 jam.
Universitas Sumatera Utara
f. Dimasukkan blocking buffer 200
μl dalam mikroplat, diinkubasi pada suhu 37
g. Blocking buffer dibuang. C selama 1 jam.
h. Dim asukkan larutan 50 μl serum sampel serum dan larutan
kertas saring yang telah diencerkan dengan dilution buffer 1:300 ke dalam mikroplat, inkubasi pada suhu 37
i. Cuci mikroplat dengan washing buffer sebanyak 3 kali.
C selama 1 jam.
j. Dimasukkan masing-
masing 50 μl 2
nd
antibodi IgM sesuai skema ke dalam mikroplat, diinkubasi 37
k. Mikroplat dicuci kembali dengan washing buffer sebanyak 3 kali.
C selama 1 jam dan diencerkan dengan dilution buffer dengan perbandingan
1:2000.
l. Substrat solution diberikan sebanyak
100 μl dalam ke dalam mikroplat hingga warna kuningjingga, hitung waktunya.
m. Reaksi pewarnaan dihentikan setelah ± 10-30 menit dihitung waktu optimasi perubahan warna paling baik
dengan menambahkan 100μl stopping solution. n. Dihitung nilai serapan optical density dengan alat ELISA
reader, data disimpan dan diolah pada suatu program komputer tertentu seperti BioliseX-read.
Universitas Sumatera Utara
3.9 Defenisi Operasional
