✝✝
3. Pembuatan larutan standar pengukuran kadar GSH
Pembuatan larutan standar untuk pengukuran kadar glutation jaringan hepar menggunakan DTNB Ditio bisnitro benzoate. Prinsip pengukuran yaitu
reaksi antara DTNB dengan GSH menghasilkan senyawa tionitro benzoat yang berwarna kuning.
Sebanyak 4 mg standar glutation dilarutkan dalam 2 mL PBS 0,1 M pH 8,0, kemudian dibuat dalam 2mgmL. Dari larutan tersebut dibuat larutan
glutation dengan berbagai kandungan 0 µL, 1 µL, 2 µL, 4 µL, 5 µL dan 10 µL. Tambahkan 200 µL TCA 5 ke dalam masing-masing tabung, kocok
sampai homogen. Tambahkan larutan PBS 0,1 M pH 8,0 ke dalam masing- masing tabung hingga volume mencapai 1.800 µL, campur hingga
homogen. Kemudian ambil 800 µL larutan ke tabung lain untuk dicampurkan dengan 25 µL DTNB, inkubasi selama 1 jam pada ruang
gelap. Larutan DTNB dibuat dari 39,6 mg DTNB yang dilarutkan dalam 10 mL PBS 0,1 M pH 7,0 dibuat dalam 3,96 mgml. Sisa larutan di dalam
tabung 1200 µL dijadikan sebagai blanko. Selanjutnya diukur serapan absorban standar terhadap blanko dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 412 nm.
Data pengukuran dibuat kurva kalibrasi dengan menghubungkan nilai serapan sebagai rata-rata ordinat sumbu y dan rata-rata konsentrasi larutan
standar µgmL sebagai absis sumbu x.
✞ ✟
4. Pengukuran kadar Glutation GSH Metode Ellman
Ke dalam 50 µL sampel homogenat jaringan hepar ditambahkan 200 µL TCA 5 dan 1.750 µL PBS pH 7,0, kocok sampai homogen. Kemudian
larutan disentrifugasi pada 3500 rpm selama 10 menit. Dari larutan tersebut diambil 800 µL supernatan dan tambahkan 25 µL DTNB, diamkan selama
1 jam pada ruang gelap. Sisa larutan supernatan digunakan sebagai blanko. Selanjutnya diukur serapan absorban sampel dan terhadap blanko dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 412 nm.
Seluruh sampel diukur dengan prinsip duplo dua kali pengukuran untuk menghindari kesalahan dalam penghitungan.
Diagram pembuatan homogenat dan pengukuran GSH terlampir lampiran II dan III.
F. Identifikasi Variabel dan Definisi Operasional Variabel
1. Identifikasi Variabel
a. Variabel Independen Variabel independen adalah dosis ekstrak etanol daun sirsak
Annona muricata L. b. Variabel Dependen
Variabel dependen adalah kadar glutation GSH jaringan hepar tikus Rattus novergicus L. yang telah diinduksi karsinogen DMBA.