15 Kadar air = bobot sampel awal b – bobot akhir c-bobot wadah a
1 bobot sampel awal b
2. Proses Ekstraksi Daun Tembakau
Metode ekstraksi tembakau yang digunakan pada penelitian ini adalah metode soxletasi dengan pelarut etanol alkohol teknis 96. Proses ekstraksi tersebut
menggunakan tembakau serbuk TS sampel A dan B sebanyak 10 g dilarutkan masing- masing dalam 100 ml pelarut dan dimasukkan dalam alat soxhlet. Soxletasi dilakukan
selama 90 menit dengan suhu 85˚C dan dilanjutkan evaporasi pada suhu 50
o
C.
3. Perhitungan Rendemen Hasil Ekstrak
Hasil ekstraksi yang diperoleh dihitung rendemennya dengan persamaan 2. Rendemen = WWo x 100 ww
2 Keterangan:
W = berat ekstrak g Wo = berat bahan yang diekstrak g
Ukuran sampel tembakau kering = 40 mesh
4. Analisis Fitokimia Harborne 1987
Alkaloid
Sebanyak 1 gram ekstrak sampel A dan B masing-masing dilarutkan dengan 5 ml kloroform dan beberapa tetes NH
4
OH dan disaring. Selanjutnya ditambahkan 10 tetes H
2
SO
4
2M yang akan membentuk lapisan asam pada bagian atasnya. Pada lapisan tersebut diteteskan pereaksi Meyer hingga membentuk endapan putih, pereaksi Wagner
hingga berwarna coklat, dan pereaksi Dragendrof hingga berwarna merah jingga.
Flavonoid
Sebanyak 0.1 gram ekstrak sampel sampel A dan B masing-masing ditambahkan 1 mL metanol dan dididihkan selama 1 menit. Terbentuknya
,
warna merah pada filtrat setelah penambahan 3 tetes H
2
SO
4
menunjukkan adanya flavonoid
Steroid dan terpenoid
Sebanyak 0.1 gram ekstrak sampel sampel A dan B masing-masing ditambahkan 5 mL etanol lalu dipanaskan pada suhu 50°C dan disaring. Filtratnya diuapkan lalu
ditambah 5 tetes eter. Lapisan eter ditambah pereaksi Liebermen Buchard 3 tetes asam pekat lalu 1 tetes H
2
SO
4
pekat. Larutan dikocok perlahan lalu dibiarkan beberapa menit. Warna merah atau ungu menunjukkan kandungan terpenoid pada sampel, sedangkan
warna hijau menunjukkan kandungan steroid.
16
5. Uji Aktivitas Antibakteri modifikasi metode Bloomfield 1991
Pembuatan Media Media NA
Nutrient agar NA sebanyak 23 g dilarutkan dalam 1 L akuades dan dipanaskan. Larutan disterilisasi pada suhu 121
o
C selama 15 menit.
Media LB
Sebanyak 1,25 g yeast extract, 0,5 g NaCl, dan 0,5 g tripton dilarutkan dalam 1 L akuades dan dipanaskan. Larutan disterilisasi pada suhu 121
o
C selama 15 menit.
Persiapan Ekstrak
Sediaan ekstrak yang digunakan sebagai sampel uji dalam penelitian ini terdiri atas ekstrak dengan konsentrasi 20 bv, 40 bv, 60 bv, 80 bv, dan
100 bv. Sebanyak 20 g, 40 g, 60 g, 80 g, dan 100 g ekstrak dilarutkan masing- masing dalam 100 ml pelarut DMSO sehingga diperoleh konsentrasi ekstrak sebesar
20 bv, 40 bv, 60 bv, 80 bv, dan 100 bv.
Uji Aktivitas Antibakteri
Peremajaan bakteri dilakukan terlebih dahulu untuk mempersiapkan bakteri yang akan digunakan dalam pengujian aktivitas antibakteri. Bakteri S. aureus dan E. coli
diregenerasi dalam larutan LB masing-masing 10 ml dan diinkubasi bergoyang shaker incubator selama 18 jam pada suhu 37
o
C, 200 rpm. Remajaan kultur bakteri ditumbuhkan dalam media NA dengan mengambil sebanyak 50 µ L bila nilai
kerapatan optikalnya OD1 dan 100 µ L bila ODnya1. Media didiamkan hingga memadat, lalu dilubangi menggunakan gel puchner sebanyak 5 lubang.
Remajaan bakteri ditumbuhkan dalam media NA sebanyak 50 µ L bila ODnya1 dan 100 µ L bila ODnya1. Media itu didiamkan hingga beku. Media lalu
dilubangi menggunakan gel puchner sebanyak 7 lubang. Masing-masing lubang diisi oleh pengenceran ekstrak etanol daun tembakau sampel A masing-masing sebanyak
50 µ L dengan berbagai konsentrasi 20, 40, 60, 80, 100, kontrol negatif DMSO dan kontrol positif tetrasiklin 10. Media tersebut kemudian diinkubasi
pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Zona bening yang terbentuk diukur diameternya menggunakan alat pengukur jangka sorong dengan rataan 3 kali ulangan dan
digunakan sebagai indikator aktivitas antibakteri.
