benzoat, kalium benzoat, kalium sulfit, kalium bisulfit, kalium nitrat, kalium nitrit, kalium propionate, kalium sorbet, kalsium propionate, kalsium sorbat, natrium
benzoate, metil p-hidroksi benzoat Analisis senyawa obat baik dalam bahan ruahan bulk, dalam sediaan
farmasi, maupun dalam cairan biologis dengan metode kromatografi dapat ditilik balik pada awal tahun 1920-an. Pada tahun 1995-an, metode kromatografi kertas
secara menaik ascending dan menurun descending telah muncul pada berbagai Farmakope untuk analisis produk-produk obat. Edisi Farmakope lanjut mulai
menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi KCKT dan kromatografi gas GC untuk analisis obat. Rohman, 2007
2.1 Deksklorfeniramin maleat
Rumus struktur :
Gambar 1. struktur Deksklorfeniramin maleat
Nama Kimia : + -2-[P-kloro-
α-[2-dimetilaminoetil]benzil]piridina maleat 1:1 Rumus Molekul
: C
16
H
19
ClN
2
.C
4
H
4
O
4
Berat Molekul : 390,87 Depkes RI, 1995
Pemerian : Serbuk hablur, putih ; tidak berbau
Kelarutan : Mudah larut dalam air, larut dalam etanol dan dalam
kloroform, sukar larut dalam benzena dan dalam eter. Depkes RI, 1995
Universitas Sumatera Utara
2.2 Kromatografi
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit dalam sampel terdistribusi antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase
diam dapat berupa bahan padat atau porus dalam bentuk molekul kecil, atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada
dinding kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas digunakan sebagai fase gerak, maka prosesnya dikenal sebagai kromatografi gas. Dalam
kromatografi cair dan jiga kromatografi lapis tipis, fase gerak yang digunakan selalu cair.
Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi
dibedakan menjadi : a
Kromatografi adsorbsi b
Kromatografi partisi c
Kromatografi pasangan ion d
Kromatografi penukar ion e
Kromatografi eksklusi ukuran, dan f
Kromatografi afinitas Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas :
a Kromatografi kertas
b Kromatografi lapis tipis
c Kromatografi cair kinerja tinggi KCKT, dan
d Kromatografi gas Rohman, 2007
2.2.1 Penggunaan Kromatografi
1. Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya
Universitas Sumatera Utara
senyawa tertentu dalam cuplikan 2.
Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing komponen
campuran 3.
Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran dalam jumlah memadai dalam keadaan murni.
2.2.2 Profil puncak dan pelebaran puncak
Selama pemisahan kromatografi, solut individual akan membentuk profil konsentrasi yang simetris atau dikenal juga dengan profil Gaussian dalam arah
aliran fase gerak. Profil dikenal juga dengan puncak atau pita, secara perlahan – lahan akan melebar dan sering juga membentuk profil yang asimetrik karena solut
– solut melanjutkan migrasinya ke fase diam. Rohman, 2007
2.2.3 Puncak asimetris
Profil konsentrasi solut yang bermigrasi akan simetris jika rasio distribusi solut D konstan selama dikisaran konsentrasi keseluruhan puncak,
sebagaimana ditunjukkan oleh isoterm sorpsi yang linear yang merupakan plot konsentrasi solut dalam fase diam Cs terhadap konsentrasi solut dalam fase
gerakCm. Meskipun demikian, kurva isot erm akan berubah menjadi 2 jenis puncak asimetris yakni membentuk puncak yang berekor tailing dan adanya
puncak pendahulu fronting jika ada perubahan rasio distribusi solut yang lebih besar.
Untuk kromatografi yang melibatkan kolom, kuantifikasi dapat dilakukan dengan luas puncak atau tinggi puncak. Tinggi puncak atau luas puncak
berbanding langsung dengan banyaknya solut yang dikromatografi, jika dilakukan pada kisaran detektor yang linier.
1. Metode tinggi puncak
Universitas Sumatera Utara
Metode yang paling sederhana untuk pengukuran kuantitatif adalah dengan tinggi puncak. Tinggi puncak diukur sebagai jarak dari garis dasar ke
puncak maksimum seperti puncak 1, 2, dan 3 pada gambar 3. Penyimpangan garis dasar diimbangi dengan interpolasi garis dasar antara awal dan akhir puncak.
Gambar 3. Pengukuran tinggi puncak
Metode tinggi puncak hanya digunakan jika perubahan tinggi puncak linier dengan konsentrasi analit. Kesalahan akan terjadi jika metode ini digunakan
pada puncak yang mengalami penyimpangan asimetris atau jika kolom mengalami kelebihan muatan.
2. Metode luas
puncak Prosedur penentuan luas puncak serupa dengan tinggi puncak. Suatu
teknik untuk mengukur luas puncak adalah dengan mengukur luas puncak sebagai hasil kali tinggi puncak dan lebar pada setengah tinggi W
12
. Teknik ini hanya dapat digunakan untuk kromatografi yang simetris atau yang mempunyai bentuk
serupa Johnson, 1991. Saat ini integrator elektronik telah banyak digunakan untuk mengukur luas
puncak pada kromatografi cair kinerja tinggi dan pada kromatografi gas. Integrator digital mengukur luas puncak dan mengubahnya dalam bentuk angka
Rohman, 2007.
Universitas Sumatera Utara
Baik tinggi puncak maupun luasnya dapat dihubungkan dengan konsentrasi. Tinggi puncak mudah diukur, akan tetapi sangat dipengaruhi
perubahan waktu retensi yang disebabkan oleh variasi suhu dan komposisi pelarut. Oleh karena itu, luas puncak dianggap merupakan parameter yang lebih
akurat untuk pengukuran kuantitatif Ditjen POM, 1995.
2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
Kromatografi cair kinerja tinggi KCKT merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh
kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara
kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran Ditjen POM, 1995.
KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang antara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa
organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian impurities dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap
nonvolatil. KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa- senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-
protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain.
Kelebihan KCKT antara lain:
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
Resolusinya baik
Universitas Sumatera Utara
Mudah melaksanakannya
Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi
Dapat dihindari terjadinya dekomposisikerusakan bahan yang dianalisis
Dapat digunakan bermacam-macam detektor
Kolom dapat digunakan kembali
Mudah melakukan rekoveri cuplikan
Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan
reprodusibilitasnya lebih baik
Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif
Waktu analisis umumnya singkat
Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar
Ideal untuk molekul besar dan ion. Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali
jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa MS. Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh
Munson, 1991.
2.3.1 Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan
penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu
kolom, dan ukuran sampel Rohman, 2007.
Universitas Sumatera Utara
2.3.2 Komponen KCKT
Gambar 4. Bagan alat KCKT
2.3.3 Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat meampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing penghilangan gas yang ada pada
fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Rohman, 2007
2.3.4 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 6000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 0,1-10 mlmenit. Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut
untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor Putra, 2007.
pompa
injektor kolom
oven detektor
Wadah solven
Data processor
Universitas Sumatera Utara
2.3.5 Injektor
Ada 3 jenis injektor, yakni syringe injector, loop valve dan automatic injector autosampler. Syringe injector merupakan bentuk injektor yang paling
sederhana Meyer, 2004.
Pada waktu sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar aliran pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom.
Sampel dapat langsung diinjeksikan ke dalam kolom on column injection atau digunakan katup injeksi Adnan, 1997.
Katup putaran loop valve ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 8, tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar
daripada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara otomatis dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual. Pada posisi
LOAD, sampel loop cuplikan dalam putaran diisi pada tekanan atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam
kolom.
Gambar 8. Tipe injektor katup putaran
Automatic injector atau disebut juga autosampler memiliki prinsip yang mirip, hanya saja sistem penyuntikannya bekerja secara otomatis Meyer, 2004.
Universitas Sumatera Utara
2.3.6 Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom
dapat dibagi menjadi dua kelompok : a.
Kolom analitik : diameter khas adalah 2 – 6 nm. Panjang kolom tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pellikular, panjang yang
umumnya adalah 50 – 100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, umumnya 10 – 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
b. Kolom preparatif : umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar
dan panjang kolom 25 – 100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada
temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom
tergantung pada mode KCKT yang digunakan. Putra, 2007.
2.3.7 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan noise yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapanrespon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan
yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam
detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam
Universitas Sumatera Utara
rentang yang luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan, terutama dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detektor
spektrofotometer UV. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan.
2.3.8 Pengolahan Data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak- puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram
Guna kromatogram:
1. Kualitatif
Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif
Luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.
3. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan dan kinerja kolom kapasitas ‘k’, selektifitas ‘
’, jumlah pelat teoritis ‘N’, jarak setara dengan pelat teoritis ‘HETP’ dan resolusi ‘R’.
2.3.9 Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel Johnson Stevenson, 1991.
Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase
Universitas Sumatera Utara
gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak.
Fase gerak harus:
Murni; tidak ada pencemarkontaminan
Tidak bereaksi dengan pengemas
Sesuai dengan detektor
Melarutkan cuplikan
Mempunyai viskositas rendah
Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan
Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas
Umumnya, pelarut-pelarut dibuang setelah digunakan karena prosedur pemurnian kembali membosankan dan mahal. Dari semua persyaratan di atas, 4
persyaratan pertama adalah yang paling penting. Gelembung udara degassing yang ada harus dihilangkan dari pelarut,
karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan Putra, 2007.
Elusi Gradien dan Isokratik
Elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu: 1.
Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap komposisi fase gerak tetap
selama elusi. 2.
Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu komposisi
fase gerak berubah-ubah selama elusi.
Universitas Sumatera Utara
Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama suatu analisis kromatografi berlangsung. Digunakan untuk meningkatkan
resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Pengaruh yang menguntungkan dari elusi gradien adalah
memperpendek waktu analisis senyawa-senyawa yang secara kuat ditahan di dalam kolom Putra, 2007.
Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Berdasarkan jenis fase gerak dan fase diamnya, jenis pemisahan KCKT dibedakan atas :
a. Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat polar, misalnya silika gel, alumina, sedangkan fase geraknya bersifat non polar seperti heksan.
b. Kromatografi Fase Terbalik
Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, yang banyak dipakai adalah oktadesilsilan ODS atau C18 dan oktilsilan C8. Sedangkan fase
geraknya bersifat polar, seperti air, metanol dan asetonitril Mulja dan Suharman, 1995.
2.4 Validasi
Validasi adalah suatu tindakan terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi
persyaratan untuk penggunaannya WHO, 1992.
Validasi metode menurut United States Pharmacopeia USP dilakukan
untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analis harus divalidasi
untuk verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk
Universitas Sumatera Utara
mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi, spesifikasi,
linieritas dan rentang, kekasaran Ruggedness dan ketahanan Robutness. Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya
diekspresikan sebagai relatif standar deviasi RSD dari sejumlah sampel yang berbeda secara signifikan secara statistik.
Batas deteksi limit of detection, LOD didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat terdeteksi.
Batas kuantitasi limit of quantitation, LOQ didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi
dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-
hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan Rohman, 2007.
Universitas Sumatera Utara
BAB III METODE PENELITIAN
2.1 Waktu dan tempat penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan Juni sampai Agustus 2011.
2.2 Alat-alat
Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat instrumen KCKT lengkap agilent LC 1220 dengan pompa, degasser DGU 20
AS, injector Autosampler, kolom Luna Phenomenex C18 250 mm x 4,60 mm, detektor UV-Vis, wadah fase gerak, vial khusus Autosampler, Sonifikator
Branson 1510, pompa vakum Gast DOA – P604 – BN, neraca analitik Mettler Toledo, membrane filter PTFE 0,5 µm dan 0,2 µm, cellulose nitrate membran
filter 0,45 µm.
2.3 Bahan-bahan
Bahan – bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu methanol grade for HPLC E.Merck®, aquabidestilata PT. Ikapharmindo Putramas, metil paraben
BPFI Badan POM RI, metil paraben PT.Brataco, kecap Mi instan Supermi kemasan plastik, kecap ABC kemasan plastik, kecap Bango kemasan plastik,
kecap botol Langkat, kecap botol Angsa, kecap Pop Mie Cup Goreng kemasan plastik, saus sachet Del monte, saus sachet Sasa, saus sachet Indofood, dan saus
Pop Mie Cup Goreng kemasan plastik.
2.4 Pengambilan sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif, artinya tidak semua anggota dalam populasi mempunyai peluang yang sama untuk terpilih menjadi
Universitas Sumatera Utara
