Pengembangan dan Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi pada Penetapan Kadar Aspartam dalam Minuman Ringan yang Beredar di Kotamadya Medan

(1)

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2013

PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA

PENETAPAN KADAR ASPARTAM DALAM MINUMAN

RINGAN YANG BEREDAR DI KOTAMADYA MEDAN

SKRIPSI

OLEH:

ALFADES

NIM 091501032


(2)

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2013

PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA

PENETAPAN KADAR ASPARTAM DALAM MINUMAN

RINGAN YANG BEREDAR DI KOTAMADYA MEDAN

SKRIPSI

Diajukan untuk melengkapi salah satu syarat untuk memperoleh

gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas

Sumatera Utara

OLEH:

ALFADES

NIM 091501032


(3)

PENGESAHAN SKRIPSI

PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA

PENETAPAN KADAR ASPARTAM DALAM MINUMAN

RINGAN YANG BEREDAR DI KOTAMADYA MEDAN

OLEH:

ALFADES

NIM 091501032

Dipertahankan dihadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

Pada Tanggal: 27 Juli 2013 Pembimbing I,

Drs. Syafruddin, M.S., Apt. NIP 194811111976031003

Pembimbing II,

Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt. NIP 195201041980031002

Panitia Penguji,

Prof. Dr. rer. nat. Effendy D.L.P., S.U., Apt. NIP 195306191983031001

Drs. Syafruddin, M.S., Apt. NIP 194811111976031003

Dra. Salbiah, M.Si., Apt. NIP 194810031987012001

Dra. Nurmadjuzita, M.Si., Apt. NIP 194809041974122001 Medan,

Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara Dekan,

Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 195311281983031002


(4)

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena limpahan rahmat kasih dan karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini yang berjudul ” Pengembangan dan Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi pada Penetapan Kadar Aspartam dalam Minuman Ringan yang Beredar di Kotamadya Medan”. Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.

Pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terimakasih kepada Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan fasilitas selama masa pendidikan. Bapak Drs. Syafruddin, M.S., Apt., dan Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt., selaku pembimbing yang telah memberikan waktu, bimbingan dan nasehat selama penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini. Ibu Poppy Anjelisa Zaitun Hasibuan, S.Si., M.Si., Apt., selaku penasehat akademik yang memberikan bimbingan kepada penulis selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi. Bapak dan Ibu staf pengajar Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah mendidik selama perkuliahan. Bapak Kepala Laboratorium Penelitian dan Staf-Staf Laboratorium Penelitian yang telah memberikan fasilitas, petunjuk dan membantu selama penelitian. Bapak Prof. Dr. rer. nat. Effendy De Lux Putra S.U., Apt., Dra. Salbiah, M.Si., Apt., Dra. Nurmadjuzita, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang memberikan masukan, kritik, arahan dan saran dalam penyusunan skripsi ini.


(5)

Penulis juga ingin mempersembahkan rasa terima kasih yang tak terhingga kepada Ayahanda R. Tampubolon dan Ibunda M.D br Siagian atas doa dan pengorbanannya dengan tulus dan ikhlas, untuk abang dan adik tersayang dan teman-teman Sains dan Teknologi Farmasi 2009 yang selalu setia memberi doa, dorongan dan semangat.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangannya, oleh karena itu sangat diharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua pihak guna perbaikan skripsi ini. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.

Medan, Penulis,

Alfades


(6)

PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA PENETAPAN KADAR ASPARTAM DALAM

MINUMAN RINGAN YANG BEREDAR DI KOTAMADYA MEDAN

Abstrak

Minuman ringan merupakan produk minuman yang banyak dikonsumsi masyarakat. Biasanya mengandung aspartam yang mempunyai tingkat kemanisan 200-400 kali sukrosa, sehingga sering ditambahkan dalam produk minuman ringan dengan tujuan penghematan biaya produksi. Dikeluarkannya pedoman persyaratan penggunaan pemanis buatan pada produk pangan oleh Badan POM RI memberikan konsekuensi akan perlunya suatu metode analisis yang praktis, akurat dan teliti. Peneliti sebelumnya telah melakukan penetapan kadar aspartam dalam minuman ringan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan perbandingan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 2,6 (17,5:82,5) dengan laju alir 1,2 ml/menit menggunakan kolom Shimpac VP-ODS (150 mm x 4,6 mm) dan dektektor UV/Vis tetapi tidak disebutkan waktu retensinya; pada pH 3,5 (15:85) dengan laju alir 1,5 ml/menit menggunakan kolom Shimpac VP-ODS (150 mm x 4,6 mm) dan detektor PDA dengan waktu retensi 4,0 menit; dan pada pH 6,0 (15:85) dengan laju alir 1,4 ml/menit menggunakan kolom Shimpac XR-ODS (50 mm x 3,0 mm) dan detektor UV/Vis dengan waktu retensi 1,15 menit. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengembangkan suatu metode alternatif pada penetapan kadar aspartam dalam minuman ringan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi menggunakan kolom Shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan detektor UV/Vis.

Dalam pengembangan metode ini, dilakukan penentuan panjang gelombang, pemilihan pH fase gerak dan komposisi fase gerak untuk mendapatkan kondisi analisis yang optimum. Uji validasi dilakukan terhadap parameter akurasi, presisi, batas deteksi dan batas kuantitasi untuk menjamin kualitas dari metode analisis.

Hasil optimasi diperoleh kondisi analisis yang optimal menggunakan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 dengan perbandingan 20 : 80, laju alir 1,2 ml/menit pada panjang gelombang 210 nm dengan waktu retensi 5,5 menit. Dari hasil uji validasi metode diperoleh persen recovery 102,85% dan RSD 0,28%, ini

menunjukkan bahwa metode memiliki akurasi dan presisi yang baik dengan batas deteksi (LOD) 7,54 µ g/ml dan batas kuantitasi (LOQ) 25,14 µ g/ml. Dari hasil

penelitian ini diperoleh kadar Aspartam dalam Nutri Sari 391,31 ± 8,48 mg/kg, Okki Koko Drink 95,97 ± 1,42 mg/kg, Ale-ale 31,39 ± 0,42 mg/kg, Jas Jus 128,86 ± 0,88 mg/kg dan Frutang 87,45 ± 1,37 mg/kg. Dapat disimpulkan bahwa kandungan aspartam dalam semua sampel minuman ringan masih memenuhi persyaratn menurut SNI 01-6993,2004, yaitu 600 mg/kg.

Kata kunci: aspartam, minuman ringan, kromatografi cair kinerja tinggi, pengembangan metode, validasi


(7)

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD IN THE DETERMINATION

OF ASPARTAME IN SOFT DRINK THAT CIRCULATE IN MEDAN

Abstract

Soft drinks are a beverage product that almost consumed by the people. Commonly softdrink contain aspartame which has 200 – 400 times sweetness of sucrose, so it is usually added in soft drink products to economize the production cost. The exit of alternative sweetener guideline requirement in food product by BPOM RI gives a consequence the need of a practical, accurate and thorough analytical method. Previous researchers have done the determination of aspartame concentration in soft drink by High Performance Liquid Chromatography with mobile phase ratio of acetonitrile: phosphate buffer pH 2.6 (17.5:82.5) in flow rate 1.2 ml/min using Shimpac colomn VP-ODS (150 x 4.6 mm) with UV/Vis detector, but it wasn’t mentioned the retention time; in pH 3.5 (15:85) with flow rate 1.5 ml/min using Shimpac colomn VP-ODS (150 x 4.6 mm) with PDA detector, it was obtained retention time 4.0 min; and in pH 6.0 (15:85) with flow rate 1.4 ml/min using Shimpac XR-ODS (50 x 3.0 mm) with UV/Vis detector, it was obtained retention time 1.15 min. The purpose of this research is to develop an alternative analysis method that can be used in determination of aspartame concentration using High Performance Liquid Chromatography using Shimpac colomn VP-ODS (250 x 4.6 mm) with UV/Vis detector.

On this development method, need to be wavelength parameter, pH of mobile phase and the ratio of mobile phase to could optimum analithical method. Validation test was done against accuracy and precission parameters, limit of detection and limit of quantitation to guarantee quality of analithical method.

Optimization result obtained optimum analytical condition in mobile phase acetonitrile : phosphate buffer pH 4.3 with ratio of mobile phase 20 : 80, flow rate 1.2 ml/min in 210 nm wavelength with retention time 5.5 min. From the validation test result, it was obtained recovery 102,85% and RSD 0.28%, it was indicated that this method had a good accuracy and precission with limit of detection (LOD) 7.54 µ g/ml and limit of quantitation (LOQ) 25.14 µ g/ml. From this research result, it was obtained that aspartame concentration in Nutri Sari was 392.31 ± 8.48 mg/kg, Okki Koko Drink 95.97 ± 1.42 mg/kg, Ale-ale 31.39 ± 0.42 mg/kg, Jas Jus 128.86 ± 0.88 mg/kg dan Frutang 87.45 ± 1.37 mg/kg. It can be seen that concentration of aspartame in all of the soft drink samples were still fulfilled with Indonesian National Standard 01-6993, 2004 (600 mg/kg).

Keywords: aspartame, soft drink, high performance liquid chromatography, method development, validation


(8)

DAFTAR ISI

Halaman

JUDUL ... i

HALAMAN JUDUL ... ii

LEMBAR PENGESAHAN ... iii

KATA PENGANTAR ... iv

ABSTRAK ... vi

ANSTRACT ... vii

DAFTAR ISI ... viii

DAFTAR TABEL ... xii

DAFTAR GAMBAR ... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... xx

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Perumusan Masalah ... 4

1.3 Hipotesis ... 4

1.4 Tujuan Penelitian ... 5

1.5 Manfaat Penelitian ... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 6

2.1 Bahan Tambahan Pangan ... 6

2.2 Pembagian Pemanis ... 7

2.2.1 Pemanis Alami ... 7

2.2.2 Pemanis Buatan ... 7


(9)

2.3.1 Sifat Fisika dan Kimia ... 8

2.3.2 Sinonim ... 10

2.3.3 Sintesis ... 10

2.3.4 Metabolisme ... 11

2.3.5 Toksisitas ... 11

2.3.6 Metode Analisis Lain untuk Penetapan Kadar 12

Aspartam ... 2.4 Kromatografi ... 12

2.4.1 Sejarah Kromatografi ... 12

2.4.2 Klasifikasi Kromatografi ... 13

2.5 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ... 15

2.5.1 Jenis KCKT ... 15

2.5.2 Proses Pemisahan dalam Kolom Kromatografi Cair 15

2.5.3 Parameter Penting dalam Kromatografi Cair ... 17

2.5.4 Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ... 22

2.6 Validasi Metode ... 26

2.6.1 Akurasi (Kecermatan) ... 27

2.6.2 Presisi (Keseksamaan) ... 28

2.6.3 Spesifitas (Selektifitas) ... 28

2.6.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ... 28

2.6.5 Linearitas ... 28

2.6.6 Rentang (Kisaran) ... 28

2.6.7 Kekuatan (Ketahanan) ... 29

2.6.8 Kekasaran (Ketangguhan) ... 29


(10)

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ... 30

3.2 Alat-alat ... 30

3.3 Bahan-bahan ... 30

3.4 Sampling Minuman Ringan ... 31

3.5 Pembuatan Fase Gerak ... 31

3.5.1 Pembuatan Dapar Fosfat 10 mM KH2PO4 (pH 2,6) . 31 3.5.2 Pembuatan Dapar Fosfat 12,5 mM KH2PO4 (pH 3,5) 31 3.5.3 Pembuatan Dapar Fosfat 41,2 mM KH2PO4 (pH 4,3) 32 3.5.4 Pembuatan Dapar Fosfat 22 mM KH2PO4 / 3 mM K2HPO4 (pH 6,0) ... 32

3.5.5 Pembuatan Fase Gerak Asetonitril ... 32

3.6 Prosedur Analisis ... 33

3.6.1 Pembuatan Pelarut ... 33

3.6.2 Pembuatan Larutan Sampel ... 34

3.6.3 Penyiapan Alat KCKT ... 34

3.6.4 Penentuan Panjang Gelombang ... 34

3.6.5 Optimasi pH Fase Gerak ... 35

3.6.6 Optimasi Komposisi Fase Gerak ... 35

3.6.7 Analisis Kualitatif ... 35

3.6.8 Analisis Kuantitatif ... 36

3.7 Validasi Metode ... 37

3.7.1 Akurasi ... 37

3.7.2 Presisi ... 38

3.7.3 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ... 38


(11)

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 41

4.1 Optimasi ... 41

4.1.1 Penetuan Panjang Gelombang ... 41

4.1.2 Optimasi pH Fase Gerak ... 42

4.1.3 Optimasi Komposisi Fase Gerak ... 43

4.2 Analisis Kualitatif ... 44

4.3 Analisis Kuantitatif ... 46

4.3.1 Penentuan Kurva Kalibrasi ... 46

4.3.2 Penetapan Kadar Analit pada Sampel yang Dianalisis ... 46 4.4 Hasil Uji Validasi ... 47

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 49 5.1 Kesimpulan ... 49

5.2 Saran ... 49

DAFTAR PUSTAKA ... 50


(12)

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 1. Data optimasi Aspartam BPFI pada sistem KCKT dengan

fase gerak asetonitril : dapar fosfat dengan berbagai variasi

pH ... 43 Tabel 2. Data optimasi Aspartam BPFI dan sampel pada sistem

KCKT dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3

dengan perbandingan yang berbeda ... 44 Tabel 3. Hasil penetapan kadar aspartam dalam minuman ringan ... 47 Tabel 4. Hasil pengujian validasi dengan parameter akurasi, presisi,

batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) aspartam pada minuman ringan Okki Koko Drink dengan


(13)

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur kimia dari aspartam ... 8

Gambar 2. Prinsip konversi produk aspartam ... 9

Gambar 3. Stabilitas aspartam dalam larutan dapar pada suhu 25 °C 9

Gambar 4. Reaksi sintesis pembentukan aspartam ... 10

Gambar 5. Diagram metabolisme aspartam ... 11

Gambar 6. Pengelompokkan kromatografi secara umum ... 14

Gambar 7. Ilustrasi proses pemisahan yang terjadi di dalam kolom KCKT ... 16

Gambar 8. Kromatogram yang diperoleh dari analisis KCKT ... 17

Gambar 9. Tiga jenis puncak ... 21

Gambar 10. Pengukuran derajat asimetris puncak ... 21

Gambar 11. Sistem KCKT secara skematik yang menunjukkan semua komponen utamanya dan gambaran grafis suatu sistem KCKT isokratik ... 22

Gambar 12. Tipe injektor katup putaran ... 24

Gambar 13. Spektrum panjang gelombang aspartam ... 41

Gambar 14. Kromatogram sampel (Okki Koko Drink) sebelum penambahan baku secara KCKT meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 45

Gambar 15. Kromatogram sampel (Okki Koko Drink) setelah penambahan baku secara KCKT meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 45


(14)

Gambar 16. Kurva kalibrasi Aspartam BPFI KCKT meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan

didteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 46 Gambar 17. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 2,6 (15:85), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 54 Gambar 18. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 2,6 (17,5:82,5), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 54 Gambar 19. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 2,6 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 55 Gambar 20. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 2,6 (22,5:77,5), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 55 Gambar 21. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 3,5 (15:85), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 56 Gambar 22. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 3,5 (17,5:82,5), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 56 Gambar 23. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 3,5 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 57


(15)

Gambar 24. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 3,5 (22,5:77,5), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan

dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 57 Gambar 25. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (15:85), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 58 Gambar 26. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (17,5:82,5), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 58 Gambar 27. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 59 Gambar 28. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (22,5:77,5), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 59 Gambar 29. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 6,0 (15:85), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 60 Gambar 30. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 6,0 (17,5:82,5), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 60 Gambar 31. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 6,0 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 61


(16)

Gambar 32. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 6,0 (22,5:77,5), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan

dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 61 Gambar 33. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (15:85), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 62 Gambar 34. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (17,5:82,5), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 62 Gambar 35. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 63 Gambar 36. Kromatogram Nutri Sari secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 63 Gambar 37. Kromatogram Jas Jus secara KCKT meggunakan kolom

shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 64 Gambar 38. Kromatogram Ale-ale secara KCKT meggunakan kolom

shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 64 Gambar 39. Kromatogram Okki Koko Drink secara KCKT

meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm 64


(17)

Gambar 40. Kromatogram Frutang secara KCKT meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan

dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 65 Gambar 41. Kromatogram Aspartam BPFI secara KCKT meggunakan

kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (22,5:77,5), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 66 Gambar 42. Kromatogram Frutang secara KCKT meggunakan kolom

shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (22,5:77,5), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 66 Gambar 43. Kromatogram Aspartam BPFI 4 ppm secara KCKT

meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm 67 Gambar 44. Kromatogram Aspartam BPFI 10 ppm secara KCKT

meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm 67 Gambar 45. Kromatogram Aspartam BPFI 20 ppm secara KCKT

meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm 68 Gambar 46. Kromatogram Aspartam BPFI 40 ppm secara KCKT

meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm 68 Gambar 47. Kromatogram Aspartam BPFI 80 ppm secara KCKT

meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm 69


(18)

Gambar 48. Kromatogram Aspartam BPFI 160 ppm secara KCKT meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2

ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm 69 Gambar 49. Kromatogram Aspartam BPFI 320 ppm secara KCKT

meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2

ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm 70 Gambar 50. Kromatogram Nutri Sari injeksi 1-6 secara KCKT

meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2

ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm 74-75 Gambar 51. Kromatogram Okki Koko Drink injeksi 1-6 secara KCKT

meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2

ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm 78-79 Gambar 52. Kromatogram Ale-ale injeksi 1-6 secara KCKT

meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2

ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm 82-83 Gambar 53. Kromatogram Jas Jus injeksi 1-6 secara KCKT

meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2

ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm 86-87 Gambar 54. Kromatogram Frutang injeksi 1-6 secara KCKT

meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2

ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 210 nm 90-91 Gambar 55. Kromatogram sampel (Okki Koko Drink) sebelum

penambahan baku injeksi 1-6 secara KCKT meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan


(19)

Gambar 56. Kromatogram sampel (Okki Koko Drink) setelah penambahan baku injeksi 1-6 secara KCKT meggunakan kolom shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 (20:80), volume penyuntikan 20 µ L dengan laju alir 1,2 ml/menit dan

dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ... 97-98 Gambar 57. Produk minuman ringan yang digunakan sebagai sampel 108

Gambar 58. Intrument KCKT (Shimadzu Prominence Series) ... 108

Gambar 59. Pompa vakum (Boeco) ... 108

Gambar 60. Neraca analitik (Boeco) ... 109

Gambar 61. Sonifikator (Branson 1510) ... 109

Gambar 62. Sonifikator (Kudos) ... 109

Gambar 63. Syringe ... 110


(20)

Lampiran 1.

DAFTAR LAMPIRAN

Gambar kromatogram hasil optimasi pH fase gerak

Halaman

dapar fosfat (pH 2,6) ... 54

Lampiran 2. Gambar kromatogram hasil optimasi pH fase gerak dapar fosfat (pH 3,5) ... 56

Lampiran 3. Gambar kromatogram hasil optimasi pH fase gerak dapar fosfat (pH 4,3) ... 58

Lampiran 4. Gambar kromatogram hasil optimasi pH fase gerak dapar fosfat (pH 6,0) ... 60

Lampiran 5. Gambar kromatogram hasil optimasi komposisi fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 ... 62

Lampiran 6. Gambar kromatogram penentuan kurva kalibrasi ... 67

Lampiran 7. Perhitungan persamaan garis regresi ... 71

Lampiran 8. Contoh perhitungan kadar aspartam dalam sampel ... 73

Lampiran 9. Kromatogram hasil penyuntikan Nutri Sari ... 74

Lampiran 10. Analisis data statistik dari hasil penyuntikan sampel Nutri Sari ... 76

Lampiran 11. Kromatogram hasil penyuntikan Okki Koko Drink ... 78

Lampiran 12. Analisis data statistik dari hasil penyuntikan sampel Okki Koko Drink ... 80 Lampiran 13. Kromatogram hasil penyuntikan Ale-ale ... 82

Lampiran 14. Analisis data statistik dari hasil penyuntikan sampel Ale-ale ... 84

Lampiran 15. Kromatogram hasil penyuntikan Jas Jus ... 86

Lampiran 16. Analisis data statistik dari hasil penyuntikan sampel Jas Jus ... 88


(21)

Lampiran 18. Analisis data statistik dari hasil penyuntikan sampel

Frutang ... 92

Lampiran 19. Data kadar aspartam dalam sampel ... 94

Lampiran 20. Gambar Kromatogram analisis perolehan kembali ... 95

Lampiran 21. Contoh perhitungan persen perolehan kembali ... 99

Lampiran 22. Data hasil perhitungan persen perolehan kembali ... 100

Lampiran 23. Data perhitungan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) ... 102

Lampiran 24. Sertifikat aspartam BPFI ... 103

Lampiran 25. Tabel distribusi t ... 104

Lampiran 26. Standar Nasional Indonesia untuk aspartam ... 105

Lampiran 27. Sampling minuman ringan ... 106

Lampiran 28. Spesifikasi sampel ... 107


(22)

PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA PENETAPAN KADAR ASPARTAM DALAM

MINUMAN RINGAN YANG BEREDAR DI KOTAMADYA MEDAN

Abstrak

Minuman ringan merupakan produk minuman yang banyak dikonsumsi masyarakat. Biasanya mengandung aspartam yang mempunyai tingkat kemanisan 200-400 kali sukrosa, sehingga sering ditambahkan dalam produk minuman ringan dengan tujuan penghematan biaya produksi. Dikeluarkannya pedoman persyaratan penggunaan pemanis buatan pada produk pangan oleh Badan POM RI memberikan konsekuensi akan perlunya suatu metode analisis yang praktis, akurat dan teliti. Peneliti sebelumnya telah melakukan penetapan kadar aspartam dalam minuman ringan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan perbandingan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 2,6 (17,5:82,5) dengan laju alir 1,2 ml/menit menggunakan kolom Shimpac VP-ODS (150 mm x 4,6 mm) dan dektektor UV/Vis tetapi tidak disebutkan waktu retensinya; pada pH 3,5 (15:85) dengan laju alir 1,5 ml/menit menggunakan kolom Shimpac VP-ODS (150 mm x 4,6 mm) dan detektor PDA dengan waktu retensi 4,0 menit; dan pada pH 6,0 (15:85) dengan laju alir 1,4 ml/menit menggunakan kolom Shimpac XR-ODS (50 mm x 3,0 mm) dan detektor UV/Vis dengan waktu retensi 1,15 menit. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengembangkan suatu metode alternatif pada penetapan kadar aspartam dalam minuman ringan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi menggunakan kolom Shimpac VP-ODS (250 mm x 4,6 mm) dengan detektor UV/Vis.

Dalam pengembangan metode ini, dilakukan penentuan panjang gelombang, pemilihan pH fase gerak dan komposisi fase gerak untuk mendapatkan kondisi analisis yang optimum. Uji validasi dilakukan terhadap parameter akurasi, presisi, batas deteksi dan batas kuantitasi untuk menjamin kualitas dari metode analisis.

Hasil optimasi diperoleh kondisi analisis yang optimal menggunakan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 4,3 dengan perbandingan 20 : 80, laju alir 1,2 ml/menit pada panjang gelombang 210 nm dengan waktu retensi 5,5 menit. Dari hasil uji validasi metode diperoleh persen recovery 102,85% dan RSD 0,28%, ini

menunjukkan bahwa metode memiliki akurasi dan presisi yang baik dengan batas deteksi (LOD) 7,54 µ g/ml dan batas kuantitasi (LOQ) 25,14 µ g/ml. Dari hasil

penelitian ini diperoleh kadar Aspartam dalam Nutri Sari 391,31 ± 8,48 mg/kg, Okki Koko Drink 95,97 ± 1,42 mg/kg, Ale-ale 31,39 ± 0,42 mg/kg, Jas Jus 128,86 ± 0,88 mg/kg dan Frutang 87,45 ± 1,37 mg/kg. Dapat disimpulkan bahwa kandungan aspartam dalam semua sampel minuman ringan masih memenuhi persyaratn menurut SNI 01-6993,2004, yaitu 600 mg/kg.

Kata kunci: aspartam, minuman ringan, kromatografi cair kinerja tinggi, pengembangan metode, validasi


(23)

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD IN THE DETERMINATION

OF ASPARTAME IN SOFT DRINK THAT CIRCULATE IN MEDAN

Abstract

Soft drinks are a beverage product that almost consumed by the people. Commonly softdrink contain aspartame which has 200 – 400 times sweetness of sucrose, so it is usually added in soft drink products to economize the production cost. The exit of alternative sweetener guideline requirement in food product by BPOM RI gives a consequence the need of a practical, accurate and thorough analytical method. Previous researchers have done the determination of aspartame concentration in soft drink by High Performance Liquid Chromatography with mobile phase ratio of acetonitrile: phosphate buffer pH 2.6 (17.5:82.5) in flow rate 1.2 ml/min using Shimpac colomn VP-ODS (150 x 4.6 mm) with UV/Vis detector, but it wasn’t mentioned the retention time; in pH 3.5 (15:85) with flow rate 1.5 ml/min using Shimpac colomn VP-ODS (150 x 4.6 mm) with PDA detector, it was obtained retention time 4.0 min; and in pH 6.0 (15:85) with flow rate 1.4 ml/min using Shimpac XR-ODS (50 x 3.0 mm) with UV/Vis detector, it was obtained retention time 1.15 min. The purpose of this research is to develop an alternative analysis method that can be used in determination of aspartame concentration using High Performance Liquid Chromatography using Shimpac colomn VP-ODS (250 x 4.6 mm) with UV/Vis detector.

On this development method, need to be wavelength parameter, pH of mobile phase and the ratio of mobile phase to could optimum analithical method. Validation test was done against accuracy and precission parameters, limit of detection and limit of quantitation to guarantee quality of analithical method.

Optimization result obtained optimum analytical condition in mobile phase acetonitrile : phosphate buffer pH 4.3 with ratio of mobile phase 20 : 80, flow rate 1.2 ml/min in 210 nm wavelength with retention time 5.5 min. From the validation test result, it was obtained recovery 102,85% and RSD 0.28%, it was indicated that this method had a good accuracy and precission with limit of detection (LOD) 7.54 µ g/ml and limit of quantitation (LOQ) 25.14 µ g/ml. From this research result, it was obtained that aspartame concentration in Nutri Sari was 392.31 ± 8.48 mg/kg, Okki Koko Drink 95.97 ± 1.42 mg/kg, Ale-ale 31.39 ± 0.42 mg/kg, Jas Jus 128.86 ± 0.88 mg/kg dan Frutang 87.45 ± 1.37 mg/kg. It can be seen that concentration of aspartame in all of the soft drink samples were still fulfilled with Indonesian National Standard 01-6993, 2004 (600 mg/kg).

Keywords: aspartame, soft drink, high performance liquid chromatography, method development, validation


(24)

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

Minuman ringan (Soft drink) berdasarkan Keputusan Kepala Badan

Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia No. HK.00.05.52.4040 tentang Kategori Pangan adalah produk minuman yang diperoleh tanpa melalui proses fermentasi dengan atau tanpa penambahan karbondioksida, dengan atau tanpa pengenceran sebelum diminum, tetapi tidak termasuk air, sari buah, susu atau susu untuk persiapan produk, teh, kopi, cokelat, produk telur, produk daging, kamir atau ekstrak sayur, sup, sari sayur dan minuman beralkohol (BPOM RI, 2006).

Pada dasarnya pemanis buatan (artificial sweeteners) termasuk ke dalam

golongan bahan tambahan kimia, yang secara substansi memiliki tingkat kemanisan lebih tinggi, yaitu berkisar antara 30 sampai dengan ribuan kali lebih manis dibandingkan sukrosa. Karena tingkat kemanisannya yang tinggi, penggunaan pemanis buatan dalam produk pangan hanya dibutuhkan dalam jumlah kecil sehingga dapat dikatakan rendah kalori atau tidak mengandung kalori. Selain itu, penggunaan pemanis buatan untuk memproduksi makanan jauh lebih murah dibanding penggunaan sukrosa (Ambarsari, dkk., 2007).

Penggunaan aspartam dalam industri produk minuman ringan masih sering digunakan dan diijinkan penggunaannya, tetapi dalam batasan tertentu. Karena itu, masyarakat Indonesia hampir setiap hari mengkonsumsi aspartam dalam jumlah tertentu baik secara terpisah maupun gabungan dengan dua atau lebih pemanis buatan lainnya. Kombinasi aspartam dengan pemanis lainnya dimaksudkan untuk meningkatkan rasa manis yang lebih, tetapi masih dalam batasan yang diijinkan (Cahyadi, 2009).


(25)

Penggunaan pemanis sintetik dapat mempengaruhi kesehatan tubuh. Penelitian telah menunjukkan bahwa pemanis seperti aspartam dapat terdekomposisi menjadi produk yang berbahaya. Salah satu konsekuensinya dapat menyebabkan gangguan penglihatan atau bahkan kebutaan. Dekomposisi pemanis dalam tubuh, berarti bahwa pemanis dikonversi melalui reaksi kimia menjadi senyawa yang berbahaya seperti metanol (Nseir, 2010).

Dalam larutan dan pada keadaan tertentu seperti pencampuran, temperatur, dan pH, ikatan ester terhidrolisis membentuk dipeptida aspartilfenilalain dan metanol. Pada akhirnya, aspartilfenilalanin dapat terhidrolisis menjadi dua asam amino, yaitu asam aspartat dan fenilalanin. Kemungkinan yang lain, metanol mungkin juga dihidrolisis dari siklisasi aspartam menjadi diketopiperazin (DKP) (Butchko, 2001). Hal serupa terjadi juga dalam tubuh, dimana aspartam akan dihidrolisis oleh enzim proteolitik yang ada dalam usus halus dan sel mukosa menjadi asam aspartat (40%), fenilalanin (50%), dan metanol (10%) (O’Donnel, 2006).

Banyaknya minuman ringan yang mengandung aspartam yang beredar di pasaran membuat peneliti tertarik untuk menetapkan kadar aspartam dalam minuman ringan yang beredar di Kotamadya Medan. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan persyaratan yang tercantum dalam SNI-01-6993-2004.

Metode penetapan kadar aspartam dapat dilakukan dengan berbagai cara diantaranya metode secara volumetri, yaitu titrasi bebas air, secara spektrofotometri Ultraviolet dan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

Pada penelitian ini dilakukan analisis pemanis aspartam di dalam minuman ringan menggunakan metode KCKT, dan untuk mendapatkan hasil analisis yang lebih optimal dan efisien, dilakukan penetuan panjang gelombang, optimasi


(26)

pH fase gerak dan komposisi fase gerak. Kondisi analisis optimum yang diperoleh diterapkan pada penetapan kadar aspartam dalam minuman ringan. Adapun alasan memilih metode ini karena analisisnya cepat, daya pisah baik, peka, kolom dapat dipakai berulang kali dan perangkatnya dapat digunakan secara otomatis dan kuantitatif (Gandjar dan Rohman, 2007).

Penelitian sebelumnya telah dilakukan penetapan kadar aspartam dalam minuman ringan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan perbandingan fase gerak asetonitril : dapar fosfat pH 2,6 (17,5:82,5) dengan laju alir 1,2 ml/menit mengunakan kolom Shimpac VP-ODS (150 mm x 4,6 mm) dengan detektor UV/Vis, tetapi tidak disebutkan waktu retensinya, pada pH 3,5 (15:85) dengan laju alir 1,5 ml/menit menggunakan kolom Shimpac VP-ODS (150 mm x 4,6 mm) dan detektor PDA (photo diode array) dengan waktu retensi 4,0 menit, dan pada pH 6,0

(15:85) dengan laju alir 1,4 ml/menit menggunakan kolom Shimpac XR-ODS (50 mm x 30 mm) dan detektor UV/Vis dengan waktu retensi 1,15 menit.

Dikeluarkannya pedoman persyaratan penggunaan pemanis buatan pada produk pangan dalam Surat Keputusan Kepala Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia No. HK.00.05.1.4547 tahun 2004, memberikan konsekuensi akan perlunya suatu metode analisis yang praktis, akurat dan teliti. Sehingga perlu adanya suatu metode alternatif untuk analisis kadar aspartam dalam minuman ringan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Validasi merupakan persyaratan mendasar yang diperlukan untuk menjamin kualitas dan hasil dari semua aplikasi analitik. Untuk menguji validitas dari metode ini dilakukan pengujian antara lain uji akurasi dengan parameter % recovery, uji

presisi dengan parameter koefisien variasi (RSD), uji sensitifitas dengan parameter limit deteksi (LOD) dan limit kuantitasi (LOQ) (Harmita, 2004).


(27)

1.2 Perumusan Masalah

Adapun yang menjadi permasalahan dalam penelitian ini adalah:s

1. Berapakah perbandingan komposisi fase gerak asetonitril : dapar fosfat dengan berbagai variasi pH pada panjang gelombang yang sesuai, sehingga diperoleh kondisi analisis yang optimal dan efisien pada penetapan kadar aspartam dalam minuman ringan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. 2. Apakah komposisi fase gerak asetonitril : dapar fosfat dengan berbagai

variasi pH pada panjang gelombang yang diperoleh dapat digunakan pada penetapan kadar aspartam dalam minuman ringan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan validasi yang memenuhi persyaratan.

3. Apakah kadar aspartam dalam minuman ringan yang beredar di Kotamadya Medan memenuhi persyaratan yang tercantum dalam SNI-01-6993-2004?

1.3 Hipotesis

Hipotesis penelitian ini adalah:

1. Perbandingan fase gerak asetonitril : dapar fosfat dengan berbagai variasi pH merupakan kondisi analisis yang optimal dan efisien pada penetapan kadar aspartam dalam minuman ringan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

2. Kondisi optimum fase gerak asetonitril : dapar fosfat dengan berbagai variasi pH dan panjang gelombang yang sesuai dapat digunakan pada penetapan kadar aspartam dalam minuman ringan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

3. Kadar aspartam dalam minuman ringan yang beredar di Kotamadya Medan memenuhi persyaratan yang tercantum dalam SNI-01-6993-2004.


(28)

1.4 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah:

1. Untuk mengetahui perbandingan asetonitril : dapar fosfat dengan berbagai variasi pH dan panjang gelombang yang sesuai, sehingga diperoleh kondisi analisis yang optimal dan efisien pada penetapan kadar aspartam dalam minuman ringan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

2. Untuk menyesuaikan kondisi optimum fase gerak asetonitril : dapar fosfat dengan berbagai variasi pH dan panjang gelombang yang diperoleh dengan validasi metode yang memenuhi persyaratan.

3. Untuk mengetahui kesesuaian kadar aspartam dalam minuman ringan yang beredar di Kotamadya Medan dengan persyaratan yang tercantum dalam SNI-01-6993-2004.

1.5 Manfaat Penelitian

Penelitian ini bermanfaat sebagai sumber informasi kepada masyarakat mengenai kadar aspartam dalam minuman ringan yang beredar di pasaran, sehingga masyarakat lebih berhati-hati dalam mengkonsumsi minuman ringan. Disamping itu, dapat digunakan sebagai metode alternatif pada penetapan kadar aspartam secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi untuk industri farmasi atau makanan dan Badan Pengawasan Obat dan Makanan.


(29)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Bahan Tambahan Pangan

Bahan Tambahan Pangan (BTP) adalah bahan yang ditambahkan ke dalam pangan untuk mempengaruhi sifat dan bentuk pangan, baik yang mempunyai atau tidak mempunyai nilai gizi (BPOM RI, 2011 dan BPOM RI, 2004).

Menurut ketentuan yang ditetapkan, ada beberapa kategori Bahan Tambahan Makanan. Pertama, Bahan Tambahan Makanan yang bersifat aman, dengan dosis yang tidak dibatasi, misalnya pati. Kedua, Bahan Tambahan Makanan yang digunakan dengan dosis tertentu, dan dengan demikian dosis maksimum penggunaannya juga telah ditetapkan. Ketiga, bahan tambahan yang aman dan dalam dosis yang tepat, serta telah mendapatkan izin beredar dari instansi yang berwenang, misalnya zat pewarna yang sudah dilengkapi sertifikat aman (Yuliarti, 2007).

Menurut Yuliarti (2007), beberapa Bahan Tambahan Makanan yang telah diizinkan oleh Badan POM, diantaranya:

1. Pengawet: natrium benzoat, kalium sorbat, nisin 2. Pewarna: tartrazin

3. Pemanis: aspartam, sakarin dan siklamat 4. Penyedap rasa: monosodium glutamat

5. Antikempal: aluminium silikat, magnesium karbonat, trikalsium fosfat 6. Antioksidan: asam askorbat, alfa tokoferol

7. Pengemulsi, pemantap dan pengental: lesitin, sodium laktat dan potassium laktat.


(30)

2.2. Pembagian Pemanis 2.2.1 Pemanis Alami

Pemanis alami yang sering digunakan untuk makanan, terutama adalah tebu dan bit. Kedua jenis pemanis ini sering disebut gula alam atau sukrosa. Selain itu ada berbagai pemanis lain yang dapat digunakan untuk makanan, diantaranya laktosa, maltosa, galaktosa, glukosa, fruktosa, sorbitol, manitol (Yuliarti, 2007).

2.2.2 Pemanis Buatan

Pemanis buatan merupakan bahan tambahan yang dapat memberikan rasa manis dalam makanan, tetapi tidak memiliki nilai gizi. Sebagai contoh adalah sakarin, siklamat, aspartam. Sekalipun penggunaannya diizinkan, pemanis buatan dan juga bahan kimia yang lain sesuai peraturan penggunaannya harus dibatasi. Alasannya, meskipun pemanis buatan tersebut aman dikonsumsi dalam kadar yang kecil, tetap saja dalam batas-batas tertentu akan menimbulkan bahaya kesehatan bagi manusia maupun hewan yang mengonsumsinya (Yuliarti, 2007).

2.3 Aspartam

Aspartam ditemukan secara kebetulan oleh James Schulter pada tahun 1965, ketika mensintesis obat-obat untuk bisul atau borok. Asparrtam adalah senyawa metil ester dipeptida, yaitu L-aspartil-L-alanin-metilester dengan rumus C14H18N2O5 memiliki daya kemanisan 100-200 kali sukrosa (Cahyadi, 2009; Tan,

2007).

Pada penggunaannya dalam minuman ringan, aspartam kurang menguntungkan karena penyimpanan dalam waktu yang lama mengakibatkan


(31)

turunya rasa manis. Selain itu, aspartam tidak tahan panas sehingga tidak baik digunakan dalam bahan pangan yang diolah melalui pemanasan (Cahyadi, 2009).

2.3.1 Sifat Fisika dan Kimia 2.3.1.1 Struktur

Gambar 1. Struktur kimia dari Aspartam (Butchko, 2001).

2.3.1.2 Rumus Molekul

C14H18N2O5 (O’Donnell, 2006).

2.3.1.3 Berat Molekul

294,30 (Glória, 2003).

2.3.1.4 Nama Kimia

(3S)-3-Amino-4-[[(2S)-1-methoxy-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-4- oxobutanoic acid (The Department of Health, 2012).

2.3.1.5 Pemerian

Senyawa yang tidak berbau, putih atau hampir putih, sedikit higroskopis, serbuk kristal (Cahyadi, 2009; Martindale, 2009; The Department of Health, 2012).

2.3.1.6 Stabilitas

Dalam larutan dan pada keadaan tertentu seperti pencampuran, temperatur, dan pH, ikatan ester terhidrolisis membentuk dipeptida aspartilfenilalain dan metanol. Pada akhirnya, aspartilfenilalanin dapat terhidrolisis menjadi dua asam amino, yaitu asam aspartat dan fenilalanin. Kemungkinan yang lain, metanol


(32)

mungkin juga dihidrolisis dari siklisasi aspartam menjadi diketopiperazin (DKP) (Butchko, 2001). Hal serupa terjadi juga dalam tubuh, dimana aspartam akan dihidrolisis oleh enzim proteolitik yang ada dalam usus halus dan sel mukosa menjadi asam aspartat (40%), fenilalanin (50%), dan metanol (10%) (O’Donnel, 2006).

O O O H2 H H H HO C

esterase

H2O

C C C NH2

N C C OH CH2 + H

3C OH

Methanol

peptidase O H O

H2 H O H H O Aspartylphenylalanine O O H2N C C

HO C C C C N C C H2 H OH

NH2 CH2

OCH3

esterase

O H2 H

H2O

HO C C C C OH + NH2

CH2

Aspartame

C C N O HO

O N C

H H2

+ H3C OH

Aspartic acid Phenylalanine

Diketopiperazine Methanol

Gambar 2. Prinsip konversi produk aspartam (Butchko, 2001).

Pada suhu 25 °C, stabilitas maksimum aspartam ditunjukkan pada pH 4,3. Aspartam berfungsi dengan sangat baik di atas interval pH 3-5, tetapi kebanyakan stabil pada suasana asam lemah yang mana kebanyakan digunakan dalam industri makanan, yaitu antara pH 3 dan 5 (Butchko, 2001; O’Donnel, 2006; Smith, 2003).

Gambar 3. Stabilitas aspartam dalam larutan dapar pada suhu 25°C (Butchko,


(33)

2.3.1.7 Kelarutan

Sedikit larut dalam air (pada suhu 20 °C, pH 4,5-6,0 sebanyak 36%) dan dalam alkohol (pada suhu 25 °C sebanyak 0,4%) (Smith, 2003); praktis tidak larut dalam diklorometana, n-heksan dan dalam metilen klorida (Martindale, 2009; The Department of Health, 2012)

2.3.2 Sinonim

N-L-α-Aspartyl-L-phenylalanine-1-Methyl Ester; Aspartylphenylalanine methyl ester; 3-Amino-N-(α-carboxyphenethyl)succinamic acid N-methyl ester; N- L-α-aspartyl-L-phenylalaninate; APM; Aspartaam; Aspartamas; Aspartamo; Aspartamum (Commite of Food Chemical Codex, 2004; Smith, 2003; The United State Pharmacopoeia Convention, 2007; Martindale, 2009).

2.3.3 Sintesis

Sintesis aspartam dalam skala besar diperoleh melalui reaksi:

Gambar 4. Reaksi sintesis pembentukan aspartam (Belitz, 2009).

Bahan baku untuk produksi aspartam adalah dua asam amino, yaitu fenilalanin dan asam aspartat. Gugus reaktif dari asam amino diproteksi pertama kali, dengan pengecualian gugus yang akan membentuk ikatan metil ester. Kedua


(34)

asam amino kemudian digandengkan dengan yang lain secara kimia atau enzimatis dan gugus reaktif dihilangkan. Langkah ini diikuti dengan tahap melarutkan dengan HCl dan kristalisasi untuk menghilangkan pengotor atau zat asing (O’Donnell, 2006).

2.3.4 Metabolisme

Aspartam dapat dihidrolisis dan dimetabolisme dalam dua jalur utama, yaitu melalui intesitnal lumen dan sel mukosa. Dalam keduanya, keadaan dosis aspartam yang besar akan melepaskan aspartat, fenilalanin dan metanol ke dalam aliran darah, dan senyawa ini dimetabolisme dan atau diekskresikan (Salminen dan Hallikainen, 2002). Aspartam diabsorbsi dan dimetabolisme mengikuti laju kinetika orde pertama. Aspartam dihidrolisis dalam usus halus oleh enzim proteolitik dan hidrolitik menjadi aspartat, fenilalanin, dan metanol (Glória, 2003).

Gambar 5. Diagram metabolisme Aspartam (Glória, 2003)

2.3.5 Toksisitas

Efek samping yang tersering timbul pada dosis tinggi dapat berupa nyeri kepala dan lambung, pusing, mual, muntah dan perubahan suasana jiwa, lebih jarang reaksi alergi dan serangan epilepsi. Ada kalanya aspartam dalam Cola light

dapat mencetuskan serangan migrain. Tidak boleh diberikan pada anak-anak dan wanita hamil dengan fenilketonuria (PKU), dimana terdapat kekurangan enzim yang mengubah fenilalanin menjadi tirosin. Sebabnya adalah fenilalanin akan menumpuk dalam darah dan dapat merusak saraf otak (Tan dan Rahardja, 2007).


(35)

2.3.6 Metode Analisis Lain untuk Penetapan Kadar Aspartam

2.3.6.1 Penetapan Kadar Aspartam dengan Metode Titrasi Bebas Air

Penetapan kadar Aspartam dengan metode titrasi bebas air menggunakan asam perklorat 0,1 N sebagai pentiter. Prosedur penetapan kadar aspartam dengan metode titrasi asam basa, yaitu dengan menimbang secara teliti 300 mg sampel (aspartam) dan dilarutkan dengan 1,5 ml asam formiat 96% dalam erlenmeyer 150 ml. Ditambah 60 ml asam asetat glasial dan kristal violet sebagai indikator, kemudian dititrasi dengan asam perklorat 0,1 N hingga terbentuk warna hijau. Setiap ml asam perklorat 0,1 N setara dengan 29,43 mg C14H18N2O5 (The United

State Pharmacopoeia Convention, 2007).

2.3.6.2 Penetapan Kadar Aspartam dengan Metode Spektrofotometri Ultraviolet

Penentuan kadar aspartam secara kuantitatif dapat dilakukan dengan spektrofotometri. Mula-mula aspartam dilarutkan dengan HCl 2 N. Kemudian panaskan supaya terjadi hidrolisis menghasilkan fenilalanin. Analisis kuantitatif memerlukan tahap pemisahan zat aktif dengan zat pengotor lainnya dengan cara ekstraksi. Ekstraksi yang dilakukan adalah ekstraksi cair-cair, yaitu zat yang telah dilarutkan diekstraksi dengan kloroform sebanyak 2 kali masing-masing 10 menit, kemudian fase organik dipisahkan dari fase air. Fase air diekstraksi kembali dengan petroleum eter selama 10 menit. Pengukuran dilakukan pada fase air (Cahyadi, 2009) pada panjang gelombang 200-217 nm (Glória, 2003).

2.4 Kromatografi

2.4.1 Sejarah Kromatografi

Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh ahli botani Rusia pada tahun 1903 yang bernama Michael Tswett untuk memisahkan pigmen warna dalam


(36)

tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi CaCO3. Oleh karena itu, diberi nama kromatografi yang berasal dari bahasa

Yunani “chroma” yang berarti warna dan “grapein” yang berarti menulis

(Wonorahardjo, 2013). Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis dan dapat dimanfaatkan untuk melalukan analisis, baik analisis kualitatif, analisis kuantitatif, atau preparatif dalam bidang farmasi, industri dan lain sebagainya (Gandjar dan Rohman, 2008).

Organisasi standar internasional IUPAC (International Union of Pure and

Applied Chemistry) mendefinisikan kromatografi sebagai metode pemisahan secara

fisika yang mana komponen-komponen yang akan dipisahkan terbagi diantara dua fase, yang satu adalah fase diam sementara yang lain adalah fase gerak yang bergerak pada arah tertentu (Gandjar dan Rohman, 2012).

2.4.2 Klasifikasi Kromatografi

Prinsip dari metode kromatografi adalah distribusi komponen sampel antara dua fase, yakni fase diam dan fase gerak. Fase diam dalam praktiknya adalah cairan yang terikat pada permukaan padatan sehingga tidak dapat bergerak, atau padatan itu sendiri. Sedangkan, fase gerak adalah cairan atau gas pembawa yang tidak bereaksi dengan senyawa-senyawa yang dipisahkan (Wonorahardjo, 2013).

Klasifikasi tipe kromatografi yang paling umum adalah berdasarkan tipe fase gerak dan fase diam. Kromatografi gas-cair atau kromatografi cair-cair, kromatografi gas, sering menjadi penanda suatu jenis kromatografi. Yang sering digunakan adalah tipe fase geraknya, seperti kromatografi gas merujuk pada fase gerak gas (dan fase diam padat atau cair, tetapi tidak disebut), kromatografi cair


(37)

menunjukkan fase gerak cair (dan fase diam padat atau cair, tetapi tidak disebut). Jika kedua fase disebut ini berarti bahwa kromatografi dibuat secara spesifik untuk tujuan tertentu (Wonorahardjo, 2013).

Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi : (a) kromatografi adsorbsi; (b) kromatografi partisi; (c) kromatografi pasangan ion; (d) kromatografi penukar ion (e) kromatografi eksklusi ukuran dan (f) kromatografi afinitas (Rohman, 2009).

Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: (a) kromatografi kertas; (b) kromatografi lapis tipis, yang kedua sering disebut kromatografi planar; (c) kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan (d) kromatografi gas (KG) (Rohman, 2009).

Gambar 6. Pengelompokkan kromatografi secara umum (Gandjar dan Rohman,


(38)

2.5 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi 2.5.1 Jenis KCKT

Hampir semua jenis campuran solut dapat dipisahkan dengan KCKT karena banyaknya fase diam yang tersedia dan selektifitas yang dapat ditingkatkan dengan mengatur fase gerak. Pemisahan dapat dilakukan dengan fase normal atau fase terbalik tergantung pada polaritas relatif fase diam dan fase gerak. Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali KCKT dikelompokkan menjadi KCKT fase normal dan KCKT fase terbalik. Berdasarkan mekanisme interaksi antara analit dengan fase diam, kromatografi cair dapat dibagi menjadi 4 metode, yakni: kromatografi fase normal (normal phase chromatography) atau disebut juga

kromatografi adsorpsi (adsorption chromatography), kromatografi fase balik

(reversed-phase chromatography), kromatografi penukar ion (ion-exchange

chromatography) dan kromatografi eksklusi ukuran (size-exclusion

chromatography) (Gandjar dan Rohman, 2008).

Kromatografi fase balik menggunakan fase diam dari silika yang dimodifikasi secara kimiawi. Fase diam yang paling popular digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) yang relatif non polar sedangkan fase geraknya relatif

lebih polar daripada fase diam. Kondisi kepolaran kedua fase ini merupakan kebalikan dari kromatografi fase normal sehingga disebut kromatografi fase balik (Meyer, 2010).

2.5.2 Proses Pemisahan dalam Kolom Kromatografi Cair

Pemisahan analit dalam kolom kromatografi berdasarkan pada aliran fase gerak yang membawa campuran analit melalui fase diam dan perbedaan interaksi


(39)

analit dengan permukaan fase diam sehingga terjadi perbedaan waktu perpindahan setiap komponen dalam campuran (Meyer, 2010).

Sebagai contoh, campuran dua komponen dimasukkan ke dalam sistem kromatografi adsorbsi (fase normal) yang dinotasikan sebagai partikel ● (nonpolar) dan ▲ (polar) (Gambar 7a). Masuknya eluen (fase gerak/nonpolar) ke dalam kolom akan menimbulkan kesetimbangan baru.

Gambar 7 . Ilustrasi proses pemisahan yang terjadi di dalam kolom KCKT (Meyer,

2010).

Molekul sampel dalam fase gerak diadsorpsi sebagian oleh permukaan fase diam berdasarkan pada koefisien distribusinya, di mana komponen ▲ cenderung menetap di fase diam dan komponen ● lebih cenderung di dalam fase gerak (Gambar 7b), sedangkan molekul yang sebelumnya diadsorpsi akan muncul kembali di fase gerak (Gambar 7c). Setelah proses ini terjadi berulang kali, kedua komponen akan terpisah. Komponen ● yang lebih suka dengan fase gerak akan berpindah lebih cepat daripada komponen ▲ yang cenderung menetap di fase diam, sehingga komponen ● akan muncul terlebih dahulu dalam kromatogram, kemudian diikuti oleh komponen ▲(Gambar 7d) (Meyer, 2010).


(40)

2.5.3 Parameter Penting dalam Kromatografi Cair 2.5.3.1 Tinggi dan Luas Puncak

Tinggi dan luas puncak berkaitan secara proporsional dengan kadar atau jumlah analit tertentu yang terdapat dalam sampel (memiliki informasi kuantitatif). Namun demikian, luas puncak lebih umum digunakan dalam perhitungan kuantitatif karena lebih akurat/cermat daripada perhitungan menggunakan tinggi puncak. Hal ini dikarenakan luas puncak relatif tidak banyak dipengaruhi oleh kondisi kromatografi, kecuali laju alir. Sementara itu, tinggi puncak dipengaruhi oleh banyak faktor seperti misalnya faktor tambat, suhu kolom serta cara injeksi sampel (Ornaf dan Dong, 2005).

Sebuah puncak memiliki lebar puncak (Wb), tinggi (h) dan luas puncak

seperti yang dapat dilihat pada Gambar 8 berikut:

Gambar 8. Kromatogram yang diperoleh dari analisis KCKT (Ornaf dan Dong,

2005).

Lebar puncak yang diukur biasanya merupakan lebar pada 5% tinggi puncak (Ornaf dan Dong, 2005).

2.5.3.2 Waktu tambat

Periode waktu antara penyuntikan sampel dan puncak maksimum yang terekam oleh detektor disebut sebagai waktu tambat/retention time (tR). Waktu


(41)

sebagai waktu hampa/void time (t0). Waktu tambat merupakan fungsi dari laju alir

fase gerak dan panjang kolom. Jika fase gerak mengalir lebih lambat atau kolom semakin panjang, waktu hampa dan waktu tambat akan semakin besar, dan sebaliknya bila fase gerak mengalir lebih cepat atau kolom semakin pendek, maka waktu hampa dan waktu tambat akan semakin kecil (Meyer, 2010).

2.5.3.3 Faktor Kapasitas

Waktu tambat dipengaruhi oleh laju alir, ukuran kolom dan parameter yang lain. Oleh karena itu, diperlukan suatu ukuran derajat tambatan dari analit yang lebih independen yaitu faktor kapasitas (k’). Faktor kapasitas dihitung dengan membagi waktu tambat bersih (t’R) dengan waktu hampa (t0) seperti yang dapat

dilihat pada rumus berikut ini (Ornaf dan Dong, 2005).

Dalam beberapa literatur lain, faktor kapasitas juga disebut sebagai faktor tambat (k). Idealnya, analit yang sama jika diukur pada dua instrumen yang berbeda namun memiliki fase diam dan fase gerak yang sama, maka faktor tambat dari analit pada kedua system KCKT tersebut secara teoritis adalah sama (Meyer, 2010).

Faktor tambat yang disukai berada diantara nilai 1 hingga 10. Jika nilai k terlalu kecil menunjukkan bahwa analit terlalu cepat melewati kolom sehingga tidak terjadi interaksi dengan fase diam dan oleh karena itu tidak akan muncul dalam kromatogram. Sebaliknya nilai k yang terlalu besar mengindikasikan waktu analisis akan panjang (Meyer, 2010).

Faktor kapasitas dipengaruhi oleh perbandingan komposisi fase gerak yang digunakan sehingga akan dihasilkan resolusi dan waktu retensi dari puncak-puncak


(42)

kromatogram yang berbeda pada setiap perbandingan komposisi fase gerak (Snyder, 2010).

2.5.3.4 Selektivitas

Kemampuan sistem kromatografi dalam memisahkan/membedakan analit yang berbeda dikenal sebagai selektivitas (α). Selektivitas umumnya tergantung pada sifat analit itu sendiri, interaksinya dengan permukaan fase diam serta jenis fase gerak yang digunakan (Meyer, 2010).

Selektivitas ditentukan sebagai rasio perbandingan dua faktor kapasitas dari analit yang berbeda. Selektivitas ditentukan dengan rumus sebagai berikut:

Nilai selektivitas yang didapatkan dalam sistem KCKT harus lebih besar dari 1 (Ornaf dan Dong, 2005).

2.5.3.5 Efisiensi Kolom

Ukuran kuantitatif dari efisiensi kolom disebut sebagai nilai lempeng/plate

number (N) (Ornaf dan Dong, 2005). Kolom yang efisien adalah kolom yang

mampu menghasilkan puncak yang sempit dan memisahkan analit dengan baik. Nilai lempeng akan semakin tinggi jika ukuran kolom semakin panjang, hal ini berarti proses pemisahan yang terjadi semakin baik. Hubungan proporsionalitas antara nilai lempeng dengan panjang kolom disebut sebagai nilai HETP/High

Equivalent of a Theoritical Plate. Praktik HPLC yang baik adalah mendapatkan

nilai HETP yang kecil untuk nilai N yang maksimum dan efisiensi kolom yang tertinggi (Snyder, 2010).


(43)

Parameter yang dapat mempengaruhi nilai lempeng antara lain waktu tambat puncak, ukuran partikel kolom, laju alir fase gerak, suhu kolom, viskositas fase gerak dan berat molekul analit. FDA merekomendasikan agar tiap analisis KCKT yang valid mempunyai nilai lempeng lebih besar dari 2000 (Meyer, 2010).

2.5.3.6 Resolusi

Resolusi merupakan derajat pemisahan dari dua puncak analit yang bersebelahan (Ornaf dan Dong, 2005).

Harga resolusi yang semakin besar memiliki arti proses pemisahan semakin bagus dan sebaliknya resolusi yang kecil merupakan pertanda proses pemisahan yang buruk. Dua puncak yang tidak terpisah dengan sempurna namun sudah dapat terlihat memiliki resolusi 1. Sedangkan bila kedua puncak yang saling berdekatan terpisah sempurna tepat pada garis alas, resolusi bernilai 1,5. Oleh karena itu pada analisis kuantitatif, resolusi yang ditunjukkan harus lebih besar dari 1,5. Sementara bila kedua puncak memiliki perbedaan yang signifikan, maka diperlukan nilai resolusi yang lebih besar (Meyer, 2010).

2.5.3.7 Faktor Ikutan dan Faktor Asimetri

Puncak kromatogram dalam kondisi ideal akan memperlihatkan bentuk Gaussian dengan derajat simetris yang sempurna (Ornaf dan Dong, 2005). Namun kenyataannya dalam praktik kromatografi, puncak yang simetris secara sempurna jarang dijumpai. Jika diperhatikan dengan cermat, maka hamper setiap puncak dalam kromatografi memperlihatkan tailing dalam derajat tertentu (Dolan, 2003).


(44)

Gambar 9. Tiga jenis puncak. (Meyer,2010)

Ada dua cara yang digunakan untuk pengukuran derajat asimetris puncak, yakni faktor ikutan dan faktor asimetri. Faktor ikutan/tailing factor (Tf) seperti yang

diterangkan dalam Farmakope Amerika Serikat (USP) Edisi Ketigapuluh dihitung dengan menggunakan lebar puncak pada ketinggian 5% (W0,05), rumusnya

dituliskan sebagai berikut:

Dengan nilai a dan b merupakan setengah lebar puncak pada ketinggian 5% seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10.

Gambar 10. Pengukuran derajat asimetris puncak (Snyder, 2010).

Sementara itu, faktor asimetri/asymmetry factor (As) dihitung dengan rumus

sebagai berikut.

Namun nilai a dan b dalam perhitungan faktor asimetri merupakan setengah lebar puncak pada ketinggian 10% seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10 . Jika nilai


(45)

a=b, maka faktor ikutan dan asimetri bernilai 1. Kondisi ini menunjukkan bentuk puncak yang simetris sempurna (Dolan, 2003). Bila puncak berbentuk tailing, maka

kedua faktor ini akan bernilai lebih besar dari 1 dan sebaliknya bila puncak berbentuk fronting, maka faktor ikutan dan asimetri akan bernilai lebih kecil dari 1

(Hinshaw, 2004).

2.5.4 Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Instrumen KCKT tersusun atas 6 bagian dasar, yakni wadah fase gerak

(reservoir), pompa (pump), tempat injeksi sampel (injector), kolom (coloumn),

detector (detector) dan perekam (recorder) (McMaster, 2007). Ilustrasi instrument

dasar KCKT dapat dilihat pada Gambar 11.

Gambar 11. (a) Sistem KCKT secara skematik yang menunjukkan semua

komponen utamanya. (b) Gambaran grafik suatu sistem KCKT isokratik (Dong, 2006).

2.5.4.1 Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum


(46)

digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak,

sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Gandjar dan Rohman, 2008).

2.5.4.2 Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 6000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 0,1-10 ml/menit. Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.5.4.3 Tempat Injeksi Sampel

Ada 3 jenis injektor, yakni syringe injector, loop valve dan automatic

injector (autosampler). Syringe injector merupakan bentuk injektor yang paling

sederhana (Meyer, 2010).

Pada waktu sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar aliran pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Sampel dapat langsung diinjeksikan ke dalam kolom (on column injection) atau digunakan

katup injeksi (Meyer, 2010).

Katup putaran (loop valve), tipe injektor ini umumnya digunakan untuk

menginjeksi volume lebih besar daripada 10 µ l dan sekarang digunakan dengan cara otomatis (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom (Meyer, 2010).


(47)

Automatic injector atau disebut juga autosampler memiliki prinsip yang

mirip, hanya saja sistem penyuntikannya bekerja secara otomatis (Meyer, 2010).

Gambar 12. Tipe Injektor katup putaran (Meyer, 2010).

2.5.4.4 Kolom

Kolom merupakan jantung dari instrument KCKT karena proses pemisahan terjadi disini. Kolom umumnya terbuat dari 316- grade stainless steel yang relative

tahan karat dan dikemas dengan fase diam tertentu. Ukuran kolom untuk tujuan analitik berkisar antara panjang 10 hingga 25 cm dan diameter dalam 3 hingga 9 cm. Sedangkan untuk tujuan preparative digunakan kolom dengan diameter 10 mm hingga 1 inchi (25,4 mm) (Meyer, 2010).

Ada 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian KCKT yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut analit (Rohman, 2009).

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

− Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100 µ l/menit)


(48)

− Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa

− Sensitifitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin (Rohman, 2009).

2.5.4.5 Detektor

Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan, yaitu detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik,dan tidak selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi dan elektrokimia (Gandjar dan Rohman, 2008).

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

− Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel

− Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil

− Stabil dalam pengoperasian

− Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita

− Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier)

− Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak (Gandjar dan Rohman, 2008).


(49)

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisaran respons linier yang

luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh (Johnson dan Stevenson, 1991).

2.5.4.6 Perekam Data

Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak- puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram (Johnson dan Stevenson, 1991).

Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, atau rekorder, dihubungkan dengan detektor.Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor lalu men-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang

selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis atau pengguna (Gandjar dan Rohman, 2008).

Rekorder saat ini jarang digunakan karena rekorder tidak dapat mengintegrasikan data, sementara itu baik integrator maupun komputer mampu mengintegrasikan puncak-puncak dalam kromatogram. Komputer mempunyai keuntungan lebih karena komputer secara elektronik mampu menyimpan kromatogram untuk evaluasi di kemudian hari (Gandjar dan Rohman, 2008).

2.6 Validasi Metode

Validasi merupakan persyaratan mendasar yang diperlukan untuk menjamin kualitas dan hasil dari semua aplikasi analitik (Ermer dan Miller, 2005).


(50)

Adapun karakteristik dalam validasi metode menurut USP (United States

Pharmacopeia) XXX yaitu akurasi (ketepatan), presisi, spesifisitas/selektifitas,

batas deteksi, batas kuantitasi, linieritas, rentang/kisaran dan kekuatan/ketahanan dan kekasaran/ketangguhan.

Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis, karenanya suatu metode harus divalidasi ketika:

− Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu

− Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus direvisi

− Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah seiring dengan berjalanya waktu

− Metode baku digunakan dilaboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh analis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda

− Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara metode baru dan metode baku (Gandjar dan Rohman, 2008).

2.6.1 Akurasi (Kecermatan)

Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai sebenarnya. Akurasi dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery) (Harmita, 2004).


(51)

2.6.2 Presisi (Keseksamaan)

Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran pada sampel yang sama dan biasanya diekspresikan sebagai Relatif Standar Deviasi (RSD) (Gandjar dan Rohman, 2008).

2.6.3 Spesifisitas (Selektifitas)

Spesifisitas/selektifitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradatif dan komponen matriks (Ermer dan Miller, 2005).

2.6.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Batas deteksi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan batas kuantitasi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi metode yang digunakan (The United States Pharmacopeia Convention, 2007).

2.6.5 Linearitas

Linieritas adalah kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil uji yang secara langsung proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linieritas dapat ditentukan secara langsung dengan pengukuran sampel (analit) yang ditambahkan baku pada sekurang-kurangnya lima titik konsentrasi yang mencakup seluruh rentang konsentrasi kerja (Ermer dan Miller, 2005).

2.6.6 Rentang (Kisaran)

Rentang/kisaran adalah konsentrasi terendah dan tertinggi yang mana suatu metode analitik menunjukkan akurasi, presisi dan linieritas yang dapat digunakan untuk menganalisis sampel (Ermer dan Miller, 2005).


(52)

2.6.7 Kekuatan (Ketahanan)

Kekuatan/ketahanan merupakan pengujian kemampuan dari suatu metode untuk tidak terpengaruh oleh adanya perubahan parameter dalam melakukan metode analitik seperti persentase kandungan pelarut organik dalam fase gerak, pH larutan dapar, waktu pengekstraksian analit, komposisi pengekstraksi dan perbandingan konsentrasi fase gerak (Épshtein, 2004).

2.6.8 Kekasaran (Ketangguhan)

Kekasaran/ketangguhan merupakan tingkat reprodusibilitas hasil yang diperoleh dengan kondisi yang bervariasi dan dinyatakan sebagai simpangan baku relatif/relative standard deviation (RSD). Kondisi ini meliputi laboratorium, analis,


(53)

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan Maret 2013 sampai Mei 2013.

3.2 Alat – alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat instrumen KCKT lengkap (Shimadzu prominence series) dengan pompa (LC-

20AD), degasser (DGU- 20As), injektor (Rheodyne 7225i), kolom Shimadzu shimpac VP- ODS (250 mm x 4,6 mm), detektor UV/Vis (SPD-20A), syringe 100 μl (Syringe perfection), spektrofotometer UV-Vis (UV Probe 1800 Shimadzu), wadah fase gerak, pH meter (Hanna), sonifikator (Branson 1510), pompa vakum (Gast DOA - P604 - BN), neraca analitik (Mettler Toledo), membran filter PTFE 0,5 dan 0,2 µ m, membran filter cellulose nitrat 0,45 µ m, dan alat-alat gelas

laboratorium.

3.3 Bahan - bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Aspartam (BPFI), Metanol grade HPLC (Merck), Asetonitril grade HPLC (Merck), Kalium

dihidrogenfosfat (Merck), Dikalium hidrogenfosfat (Merck), Asam fosfat (Merck),

Buffer standard pH 4,01 dan 7,01 (Hanna), Aqua bidestilata (PT. Ikapharmindo

Putramas), Nutri Sari rasa jeruk, Jas Jus rasa jambu biji merah, Ale-ale rasa stroberi, Okki Koko Drink Nata Dekoko rasa stroberi dan Frutang rasa jeruk.


(54)

ingan

=

dilak

+

g aka

= 3.4 Sampling Minuman ringan

Proses sampling minuman r ukan dengan menggunakan rumus: √ 1

Keterangan: n = jumlah sampel yang diteliti N = jumlah sampel dalam populasi

Pemilihan sampel yang akan dianalisis dilakukan dengan cara pemilihan secara acak

(random sampling) (Nickerson, 2011; Torbeck, 2009).

Dari survey (dapat dilihat pada Lampiran 27) yang dilakukan, jumlah minuman ringan yang mengandung aspartam diperoleh sebanyak 14 minuman ringan. Maka, jumlah sampel yan n diteliti:

√14 + 1

n = 4,74 n = 5 sampel

3.5 Pembuatan Fase Gerak

3.5.1 Pembuatan Dapar Fosfat 10 mM (pH 2,6)

Ditimbang secara seksama kalium dihidrogenfosfat 1,36 gram, dilarutkan dengan 820 ml akuades dalam beaker glass 1 L. Atur pH 2,6 dengan penambahan asam fosfat. Kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 1 L, dicukupkan volume dengan penambahan akuades hingga garis tanda. Cek pH kembali jika perlu, lalu disaring dengan menggunakan membran filter celllulosa nitrat 0,45 µ m,

kemudian diawaudarakan selama ± 30 menit (Balai POM Medan, 2005).

3.5.2 Pembuatan Dapar Fosfat 12,5 mM (pH 3,5)


(55)

dengan 820 ml akuades dalam beaker glass 1 L. Atur pH 3,5 dengan penambahan asam fosfat. Kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 1 L, dicukupkan volume dengan penambahan akuades hingga garis tanda. Cek pH kembali jika perlu, lalu disaring dengan menggunakan membran filter celllulosa nitrat 0,45 µ m,

kemudian diawaudarakan selama ± 30 menit (Serdar, 2011).

3.5.3 Pembuatan Dapar Fosfat 41,2 mM (pH 4,3)

Ditimbang secara seksama kaliumdihidrogenfosfat 5,6 gram, dilarutkan dengan 820 ml akuades dalam beaker glass 1 L. Atur pH 4,3 dengan penambahan asam fosfat. Kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 1 L, dicukupkan volume dengan penambahan akuades hingga garis tanda. Cek pH kembali jika perlu, lalu disaring dengan menggunakan membran filter celllulosa nitrat 0,45 µ m,

kemudian diawaudarakan selama ± 30 menit (CFCC, 2004; USP 30, 2009).

3.5.4 Pembuatan Dapar Fosfat 22 mM KH2PO4/3 mM K2HPO4 (pH 6,0)

Ditimbang secara seksama kalium dihidrogenfosfat 2,992 gram dan dikalium hidrogenfosfat 0,408 gram, dilarutkan dengan 820 ml akuades dalam beaker glass 1 L. Atur pH 6,0 dengan penambahan asam fosfat. Kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 1 L, dicukupkan volume dengan penambahan akuades hingga garis tanda. Cek pH kembali jika perlu, lalu disaring dengan menggunakan membran filter celllulosa nitrat 0,45 µ m, kemudian diawaudarakan

selama ± 30 menit (Shimadzu, 2007).

3.5.5 Pembuatan Fase Gerak Asetonitril

Disaring sebanyak 500 ml Asetonitril grade HPLC dengan menggunakan membran


(56)

3.6 Prosedur Analisis 3.6.1 Pembuatan Pelarut

3.6.1.1 Pembuatan Pelarut Asetonitril : Dapar Fosfat (15:85)

Disaring 150 ml asetonitril grade HPLC dengan menggunakan membran filter cellulose nitrat 0,45 µ m, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 1000

ml dan dicukupkan dengan dapar fosfat dengan variasi pH 2,6; 3,5; 4,3 dan 6,0 yang telah disaring dengan menggunakan membran filter cellulose nitrat 0,45 µ m,

kemudian diawaudarakan ± 30 menit.

3.6.1.2 Pembuatan Pelarut Asetonitril : Dapar Fosfat (17,5:82,5)

Disaring 175 ml asetonitril grade HPLC dengan menggunakan membran filter cellulose nitrat 0,45 µ m, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 1000

ml dan dicukupkan dengan dapar fosfat dengan variasi pH 2,6; 3,5; 4,3 dan 6,0 yang telah disaring dengan menggunakan membran filter cellulose nitrat 0,45 µ m,

kemudian diawaudarakan ± 30 menit.

3.6.1.3 Pembuatan Pelarut Asetonitril : Dapar Fosfat (20:80)

Disaring 200 ml asetonitril grade HPLC dengan menggunakan membran filter cellulose nitrat 0,45 µ m, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 1000

ml dan dicukupkan dengan dapar fosfat dengan variasi pH 2,6; 3,5; 4,3 dan 6,0 yang telah disaring dengan menggunakan membran filter cellulose nitrat 0,45 µ m,

kemudian diawaudarakan ± 30 menit.

3.6.1.4 Pembuatan Pelarut Asetonitril : Dapar Fosfat (22,5:77,5)

Disaring 225 ml asetonitril grade HPLC dengan menggunakan membran filter cellulose nitrat 0,45 µ m, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 1000


(1)

Lampiran 26. Standar Nasional Indonesia Aspartam Aspartam (Aspartame), INS. No. 951

Nilai kalori: 0,4 kkal/g atau setara dengan 1,67 kJ/g. ADI: 50 mg/kg berat badan.

Penggunaan Aspartam berdasarkan kategori pangan No.

kategori

pangan Kategori pangan

Batas penggunaan

maksimum (mg/kg) 13.5 Makanan khusus (misalnya: suplemen makanan

untuk diet) selain dari produk-produk pada kategori pangan 13.1-13.4

2000

13.6 Suplemen makanan 5500

14.1.2 Jus buah-buahan dan jus sayur-sayuran 2000 14.1.3 Nektar buah-buahan dan nektar sayur-sayuran 2000

14.1.4.1 Minuman berkarbonasi 600

14.1.4.2 Minuman non-karbonasi, termasuk punches dan

ades 600

14.1.5 Kopi, kopi pengganti, the, herbal infusions, sereal panas lainnya dan minuman dari biji/buah selain kakao

CPPB

14.2.1 Bir dan minuman dari gandum 600

14.2.2 Cider dan perry 600

14.2.3 Minuman anggur 600

14.2.4 Wines (selain dari anggur) 700

14.2.5 Mead 700

14.2.6 Minuman beralkohol dengan kadar alcohol lebih

dari 15% 700


(2)

dilaku

=

kan d

+

diteli

=

Lampiran 27. Sampling Minuman Ringan

Proses sampling minuman ringan engan menggunakan rumus:

√ 1

Keterangan: n = jumlah sampel yang diteliti N = jumlah sampel dalam populasi

Pemilihan sampel yang akan dianalisis dilakukan dengan cara pemilihan secara acak (random sampling).

1. Vegeta 6. Extra Joss 11. Frutang rasa jeruk 2. Jas Jus 7. Pop Ice Es Blender 12. Ale-ale

3. Nutri Sari 8. Kuku Bima Energi 13. Okki Koko Drink 4. Adem Sari 9. Segar Sari Frenta 14. Frutang asam jawa 5. Hemaviton Jreng 10. Pop Drink

Jumlah sampel yang didata (populasi) = 14 sampel. Maka, jumlah sampel yang akan ti :

√14 + 1

n = 4,74 n = 5 sampel


(3)

Lampiran 28. Spesifikasi Sampel 1. Nutri Sari Rasa Jeruk

Exp. Date: Juli 2014 Kode Produksi: N0410CY

Komposisi : sukrosa, serbuk jeruk, pengatur keasaman (asam sitrat & Na sitrat), perisa jeruk, mineral trikalsium fosfat, premiks vitamin, aspartam, asesulfam-K, karboksimetilselulosa, tertrazine Cl 19140, sunset yellow Cl 15980

2. Okki Koko Drink Rasa Stroberi Exp. Date: Maret 2014

Kode Produksi: 16:02 1C 21

Komposisi: air, nata de coco, fruktosa, asam sitrat, perisa stroberi, siklamat, aspartam, kalsium laktat, Na benzoat, gum gellan, ekstrak stroberi, karmoisin Cl 14720.

3. Jas Jus Rasa Jambu Exp. Data: Mei 2014 Kode Produksi: -

Komposisi: gula, asam sitrat & Na sitrat, Na karboksimetil sellulosa, konsentrat jambu, perisa jambu, siklamat, aspartam, trikalsium fosfat, vit. C, ponceau 4R Cl 16255.

4. Ale-ale Rasa Stroberi Exp. Date: November 2013 Kode Produksi: 15:18 14D

Komposisi: air, gula, asam sitrat, konsentrat stroberi, perisa stroberi, alfa tokoferol dan BHA, Na benzoat, aspartam, asesulfam-K, vit. C, karmoisin Cl 14720.

5. Frutang Rasa Jeruk

Exp. Date: November 2013 Kode Produksi: B06:05

Komposisi: air, gula pasir, asam sitrat, perisa jeruk, alfa tokoferol, konsentrat jeruk, vit. C, Kalium sorbat, asesulfam-K, aspartam, tartrazine Cl 19140, kuning FCF 15985.


(4)

Lampiran 29. Gambar Sampel dan Alat yang Digunakan

Gambar 57. Produk minuman ringan yang digunakan sebagai sampel

Gambar 58. Instrument KCKT (Shimadzu Prominence Series)


(5)

Gambar 60. Neraca analitik (Boeco)


(6)

Gambar 63. Syringe