BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Lokasi dan waktu penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari-Maret 2011 di Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara dan Laboratorium
Kesehatan Medan.
3.2 Metode Penelitian
Penelitian dilakukan dengan metode eksperimental dengan tahapan meliputi pengumpulan sampel dan pembuatan simplisia, pemeriksaan karakteristik simplisia,
skrining fitokimia, pembuatan ekstrak, dan uji aktivitas antibakteri dari ekstrak daun pacar air terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis dan
Pseudomonas aeruginosa. Penentuan aktivitas antibakteri ekstrak daun pacar air dilakukan dengan metode difusi agar. Prinsip metode ini adalah menggunakan media
padat dan cakram kertas, kemudian daya hambat zona jernih bakteri ditentukan dengan mengukur diameter daerah hambat pertumbuhan.
3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat
Alat- alat yang digunakan adalah seperangkat alat perkolator, Alat-alat gelas, blender National, oven listrik Fisher scientific, Neraca kasar Ohaus, Neraca
listrik Mettler Toledo, rotary evaporator Haake D, freeze dryer Modulio, seperangkat alat destilasi, cawan porselin berdasar rata, desikator, aluminium foil,
cawan porselin, mikroskop Olympus, tanur Ney M 525 Series II, krus porselin, objek glass, deck glass, autoklaf Webeco, inkubator Memmert, penangas air,
Universitas Sumatera Utara
spatula, lemari pendingin Toshiba, jarum ose, pinset, kertas cakram, lampu bunsen, lemari pengering, kertas Perkamen, cawan Petri, jangka sorong.
3.3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah daun pacar air, bahan-bahan kimia pro analisa, kecuali dinyatakn lain: air suling, asam klorida encer, asam klorida pekat,
besi III klorida, alfa naftol, bismuth III nitrat, timbal II asetat, Merkuri II klorida, asam sulfat pekat, n-heksan, kalium iodida, iodium, isopropanol, metanol,
barium klorida, asam asetat anhidrat, larutan fisiologi NaCl 0,9 , Serbuk magnesium, amil alkohol, kloralhidrat, toluen, kloroform, Muller Hinton Agar
MHA, Nutrient Agar NA, Suspensi standar Mc.Farland, biakan bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 dan
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.4.1 Larutan pereaksi Mayer
Campurkan 60 ml larutan Raksa II Klorida dan 10 ml larutan Kalium Iodida, tambahkan air secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.2 Larutan pereaksi Dragendorff
Campur 20 ml larutan Bismuth III Nitrat dalam Asam Nitrat lalu tambahkan dengan 50 ml larutan Kalium Iodida diamkan sampai memisah sempurna. Ambil
larutan jernih dan encerkan dengan air secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.3 Larutan pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g Kalium Iodida dilarutkan dalam 20 ml air suling kemudian ditambah 2 g Iodium sambil diaduk sampai larut, lalu cukupkan dengan air suling
hingga 100 ml Depkes RI, 1980.
Universitas Sumatera Utara
3.4.4 Larutan pereaksi Lieberman-Bourchard
Campurkan 5 bagian volume Asam Sulfat dengan 50 bagian volume etanol. Tambahkan hati-hati 5 bagian volume Asetat Anhidrat ke dalam campuran tersebut,
dinginkan Depkes RI, 1995.
3.4.5 Larutan pereaksi Molish
Ditimbang sebanyak 3 g Alfa Naftol dilarutkan dalam Asam Nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.6 Larutan pereaksi Timbal II Asetat 0,4 M
Ditimbang sebanyak 15,17 g Timbal II Asetat dilarutkan dalam air hingga 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.7 Larutan peraksi Besi III Klorida 1
Ditimbang sebanyak 1 g Besi III Klorida dilarutkan dalam air suling hingga diperoleh larutan 100 ml kemudian disaring Depkes RI, 1995.
3.4.8 Larutan pereaksi Asam Sulfat 2 N Sebanyak 5,5 ml Asam Sulfat pekat diencerkan dengan air suling hingga
100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.9 Larutan Pereaksi Asam Klorida 2 N Sebanyak 17 ml Asam Klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga
100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.10 Larutan pereaksi Kloralhidrat
Larutkan 50 g Kloralhidrat dalam 20 ml air Depkes RI, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.5 Penyiapan Bahan Tumbuhan 3.5.1 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada
lampiran 1 halaman 42. 3.5.2 Pengumpulan Tumbuhan
Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan yang digunakan untuk
penelitian adalah daun pacar air yang bunganya berwarna ungu, bagian daun yang diambil daun yang tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua yaitu daun keempat dari
atas dan daun kedua dari bawah. Daun pacar air diambil dari lahan kebun di daerah Pales Raya VII, Medan. Gambar tumbuhan pacar air dan daun pacar air segar dapat
dilihat pada lampiran 2 halaman 43.
3.5.3 Pembuatan Simplisia
Pembuatan daun pacar air dilakukan dengan cara daun pacar air yang masih segar dibersihkan dari kotoran yang melekat kemudian dicuci dengan air bersih,
ditiriskan dan ditimbang berat basahnya 5,5 kg. Daun pacar air selanjutnya dikeringkan dalam lemari pengering pada suhu 40-60
C sampai simplisia rapuh sekitar satu minggu. Kemudian ditimbang berat kering simplisia yaitu 0,500 kg.
Selanjutnya simplisia diserbuk menggunakan blender dan ditimbang beratnya 0,480
kg. Kemudian disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat. Gambar simplisia
daun pacar air dapat dilihat pada lampiran 2 halaman 44.
Universitas Sumatera Utara
3.6 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia yang meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air,
penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam Depkes RI, 1989.
3.6.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap daun pacar air segar dan simplisia daun dengan cara mempehatikan bentuk, bau, warna dan rasa. Hasil
pemeriksaan makroskopik dapat dilihat pada lampiran 2 halaman 43 dan 44.
3.6.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan ini dilakukan terhadap irisan melintang dari daun pacar air segar dan serbuk simplisia. Pemeriksaan mikroskopik untuk irisan melintang tumbuhan
segar dilakukan sebagai berikut: dibuat irisan melintang daun pacar air. Hasil irisan tipis diletakkan di atas objek gelas lalu ditetesi larutan kloralhidrat, dipanaskan
dengan lampu spiritus, ditutup dengan kaca penutup dan dilihat di bawah mikroskop pada berbagai perbesaran. Hasil pemeriksaan dilihat pada lampiran 3 halaman 45.
Pemeriksaan mikroskopik untuk serbuk simplisia dilakukan sebagai berikut: sejumlah serbuk simplisia diletakkan merata di atas objek gelas yang telah ditetesi
larutan kloralhidrat, ditutup dengan kaca penutup dan dilihat di bawah mikroskop pada berbagai perbesaran. Hasil pemeriksaan dilihat pada lampiran 3 halaman 46.
3.6.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi Destilasi Toluen. Kedalam labu alas bulat di masukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling, destilasi
selama 2 jam, biarkan menjadi dingin selama 30 menit dan volume air dalam tabung
Universitas Sumatera Utara
penampung dibaca. Selanjutnya ke dalam labu dimasukkan 5 gram serbuk simplisia lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena mendidih, kecepatan
tetesan diatur yaitu 2 tetesan per detik sampai sebagian air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik. Setelah semua air terdestilasi,
bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penampung dibiarkan dingin sampai sama dengan suhu kamar.
Setelah air dan toluena memisah sempurna, dibaca volume air dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air di dalam
bahan yang diperiksa WHO, 1992.
3.6.4 Penetapan Kadar Sari yang Larut dalam Air
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml campuran air dan kloroform 2,5 ml kloroform dalam air
sampai 1000 ml dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Disaring, sejumlah 20 ml filtrat
diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata dan telah ditara, sisanya dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1989.
3.6.5 Penetapan Kadar Sari yang Larut dalam Etanol
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok
sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring, 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata
yang telah ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar
Universitas Sumatera Utara
sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1989.
3.6.6 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 gram serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan.
Krus dipijar pada suhu 600
o
C sampai arang habis. Selanjutnya didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang
telah dikeringkan di udara WHO, 1992.
3.6.7 Penetapan Kadar Abu yang Tidak Larut dalam Asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida 2 N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu dan dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijar pada suhu 600
o
C sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap
bahan yang telah dikeringkan WHO, 1992.
3.7 Skrining fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia dan ekstrak daun pacar air meliputi pemeriksaan senyawa golongan glikosida, alkaloida, steroidatriterpenoida,
flavonoida, tanin dan saponin.
3.7.1 Pemeriksaan Glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 ml bagian etanol 96 dan 3 bagian volum air suling ditambah dengan
10 ml HCL 2 N. Direfluks selama 30 menit, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, lalu
Universitas Sumatera Utara
didiamkan selama 5 menit dan disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran 3 bagian kloroform dan 2 isopropanol dilakukan berulang sebanyak tiga kali.
Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 C. Sisanya dilarutkan
dalam 2 ml metanol. Kemudian diambil 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan kedalam tabung reaksi, diuapkan di penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan
5 tetes pereaksi Molish. Kemudian secara perlahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, jika terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan
menunjukkan adanya glikosida Depkes RI, 1989.
3.7.2 Pemeriksaan Alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida dan 9 ml air suling, dipanaskan air selama 2 menit, didinginkan lalu disaring.
Filtrat dipakai untuk percobaan berikut : a.
Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer.
b. Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Bourchardat.
c. Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendroff.
Alkaloida dianggap positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua atau tiga dari percobaan diatas Depkes RI, 1989.
3.7.3 Pemeriksaan SteroidaTriterpenoida
Sebanyak 1 g sampel di maserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 2 tetes asam
asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna ungu merah menunjukkan adanya triterpenoida atau warna hijau biru menunjukkan adanya
steroida Farnsworth, 1966.
Universitas Sumatera Utara
3.7.4 Pemeriksaan Flavonoida
Sebanyak 10 g sebuk simplisia kemudian ditambahkan 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, filtrat yang diperoleh
kemudian diambil 5 ml lalu di tambahkan 0,1 g serbuk Mg dan 1 ml HCl pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok, dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi
warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.7.5 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml larutan lalu
ditambahkan 1 sampai 2 ttes pereaksi besi III klorida. Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966.
3.7.6 Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0,5 g sampel dimasukkan dalam tabung reaksi dan di tambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik, timbul
busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm. Ditambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2 N, bila buih tidak hilang menunjukkan adanya saponin
Depkes RI, 1989.
3.8 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara perkolasi. Prosedur pembuatan ekstrak : sebanyak 300 gram serbuk simplisia dibasahi dengan etanol 96 dan
dibiarkan selama 3 jam. Kemudian dimasukkan ke dalam perkolator. Lalu dituang cairan penyari etanol sampai semua simplisia terendam, mulut tabung perkolator
ditutup dengan aluminium foil dan biarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka dan biarkan cairan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, perkolat ditampung,
Universitas Sumatera Utara
ditambahkan berulang-ulang cairan penyari secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari diatas simplisia. Perkolasi dihentikan hingga bila 500 mg perkolat
yang keluar terakhir diuapkan tidak meninggalkan sisa. Perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat penguap rotary evaporator pada tekanan rendah dengan suhu
tidak lebih dari 50 C
setelah itu dipekatkan menggunakan freeze dryer hingga diperoleh ekstrak kental Ditjen POM, 1979. Bagan pembuat ekstrak dapat dilihat
pada lampiran 4 halaman 49.
3.9 Sterilisasi Alat
Sterilisasi untuk alat-alat yang digunakan antara lain: 1.
Alat–alat yang terbuat dari gelas dibungkus dengan kertas perkamen, disterilkan menggunakan oven pada suhu 170
C selama 1 jam. 2.
Alat-alat jenis lainnya seperti kertas cakram, media disterilkan di autoklaf pada suhu 121
C selama 15 menit. 3.
Jarum ose dan pinset disterilkan dengan cara dibakar pada lampu bunsen. 4.
Sebelum mulai daerah sekitar pengerjaan disemprot dengan etanol 70 dan dibiarkan selama 15 menit sebelum digunakan.
5. Meja dibersihkan dari debu dan dilap menggunakan desinfektan Lay, 1994.
3.10 Pembuatan media 3.10.1 Nutrient Agar
Kategori