penangas air selama 30 menit pada suhu 63°C. Media agar yang sudah steril dicampur dengan media skim milk. Sebanyak 1 g feses dilarutkan dalam 10 ml
akuades. Sampel diencerkan hingga 10¯
12
, lalu diinokulasikan 0,1 ml suspensi bakteri ke media SMA dan disebar. Kultur diinkubasi pada suhu 30°C selama 24-
48 jam dan diamati zona beningnya Lampiran 2 hal. 30. Koloni yang membentuk zona bening diamati dan dikarakterisasi bentuk, tepi, elevasi, warna
koloni dan berdasarkan pewarnaan sifat gram serta dilakukan uji biokimia seperti uji pati, uji sitrat, uji gelatin, uji motilitas, uji sulfida dan uji katalase Lampiran 3
hal. 31. Isolat murni disimpan pada media SMA miring sebagai stok kultur.
3.4 Uji Aktivitas Proteolitik Isolat Secara Kualitatif
Sebanyak 10 μl suspensi bakteri dengan OD
600
=0,5 dipipet di atas kertas cakram steril dan kemudian diletakkan di permukaan media SMA. Kultur
diinkubasi pada suhu 30°C selama 3 hari dan setiap harinya diukur besar diameter zona bening yang terbentuk. Zona hidrolisis protein secara kualitatif diukur
dengan membandingkan diameter zona bening dengan diameter koloni bakteri Lampiran 4 hal. 32.
3.5 Pertumbuhan Isolat Pada Media Feather Meal Agar
Bulu ayam yang telah direndam selama 1 malam dengan aseton kemudian dikeringkan. Bulu ayam ditumbuk halus hingga teksturnya menjadi bubuk. Media
feather meal agar FMA dibuat dengan menggunakan metode Agrahari
Wadhwa 2010 yang telah dimodifikasi Lampiran 9 hal. 37, dengan mencampurkan bubuk bulu ayam sebanyak 5 g, agar 10 g, NaCl 0,25 g, KH
2
PO
4
0,35 g, K
2
HPO
4
0,7 g, MgSO
4
0,05 g dan ekstrak yeast 0,5 g dalam 500 ml akuades. Media FMA dipanaskan di atas hot plate hingga homogen dan
disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 20 menit. Isolat bakteri terpilih pada media SMA, diinokulasikan ke media FMA dengan
menggunakan metode cawan gores lalu diinkubasi pada suhu 30°C selama 24-48 jam. Uji positif ditandai dengan adanya zona bening yang terbentuk di sekitar
koloni bakteri.
3.6 Uji Aktivitas Keratinolitik Secara Kualitatif
Sebanyak 10 μl suspensi bakteri dengan OD
600
=0,5 dipipet di atas kertas cakram steril dan kemudian diletakkan di permukaan media FMA. Kultur
diinkubasi pada suhu 30°C selama 1 minggu dan setiap harinya diukur besar diameter zona bening yang terbentuk. Zona hidrolisis protein secara kualitatif
diukur dengan membandingkan diameter zona bening dengan diameter koloni bakteri Lampiran 5 hal. 33.
3.7 Pengukuran Potensi Bakteri Keratinolitik
Pengukuran potensi bakteri keratinolitik dalam mendegradasi limbah keratin dilakukan pada media cair yang dibuat dengan menggunakan metode
Matikeviciene et al. 2009 yang telah dimodifikasi Lampiran 9 hal. 37, yang mengandung NaCl 0,25 g, K
2
HPO
4
0,7 g, KH
2
PO
4
0,35 g, MgSO
4
0,05 g dan yeast ekstrak 0,5 g dalam 500 ml akuades. Media cair sebanyak 45 ml dimasukkan
ke dalam botol berukuran sedang yang berisi limbah keratin sebanyak 0,5 g kemudian disterilisasi. Limbah keratin yang digunakan adalah bulu ayam dan
rambut kambing. Isolat bakteri keratinolitik yang digunakan merupakan dua isolat bakteri yang memiliki indeks keratinolitik terbesar. Suspensi bakteri sebanyak 5
ml diinokulasikan ke dalam media cair yang sudah disterilkan dan kontrol disiapkan dengan perlakuan yang sama tanpa penambahan isolat. Kultur
diinkubasi selama 25 hari pada suhu 30°C dan setiap harinya diguncang. Setelah 25 hari inkubasi, kultur disaring dengan kertas saring dan dikeringkan selama 24
jam Lampiran 6 hal. 34. Potensi bakteri keratinolitik dalam mendegradasi keratin dievaluasi dengan menimbang bobot kering limbah keratin sisa degradasi
hari ke-25 dengan bobot kering limbah keratin awal hari ke-0, dengan menggunakan
ai berikut: rumus persentase penurunan berat kering sampel sebag
Penurunan berat kering Bk awal – Bk akhir
Bk awal X
Untuk melihat peptida atau asam amino terlarut, masing-masing filtrat hasil sisa penyaringan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10
menit. Supernatan dimasukkan ke dalam kuvet dan diukur serapan optical density OD pada panjang gelombang 280 nm Lampiran 7 hal. 35.
Pertumbuhan bakteri selama inkubasi diukur dengan metode Total Plate Count
TPC pada hari inkubasi ke-0, 10 dan 25, dengan dilakukan pengulangan sebanyak 2 kali untuk setiap perlakuan isolat bakteri Lampiran 8 hal. 36. Untuk
perhitun s
g dengan umus: gan estimasi jumlah el dapat dihitun
r
Estimasi Junlah Sel Jumlah Koloni x Faktor Pengenceran CFUml
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
