Zat pemanis sintetis merupakan zat yang dapat menimbulkan rasa manis atau dapat mambantu mempertajam penerimaan terhadap rasa manis tersebut,
sedangkan kalori yang dihasilkannya jauh lebih rendah daripada gula Winarno, 1997.
2.4.1 Siklamat
Siklamat pertama kali ditemukan dengan tidak sengaja oleh Michael Sveda pada tahun 1937. Sejak tahun 1950 siklamat ditambahkan kedalam pangan dan
minuman. Tidak seperti sakarin, siklamat berasa manis tanpa rasa ikutan yang kurang
disenangi. Bersifat mudah larut dalam air dan intensitas kemanisannya ±30 kali kemanisan sukrosa. Siklamat biasanya tersedia dalam bentuk garam natrium dari
asam siklamat dengan rumus molekul C
6
H
11
NHSO
3
Na. Adapun struktur kimianya dapat dilihat pada gambar berikut.
Gambar 2.2 Struktur Natrium Siklamat Kombinasi dengan sakarin bersifat sinergis. JECFA menetapkan
acceptable daily intake ADI untuk siklamat sebesar 11 mgkg bbhari. Penggunaan pada sirup esens tidak lebih dari 1000 mgkg BSN, 2004.
Universitas Sumatera Utara
2.5 Kromatografi
Kromatografi pertama sekali diperkenalkan oleh Mikhail Tswett, seorang ahli botani Rusia pada tahun 1903. Beliau memisahkan pigmen yang terdapat dalam
daun dengan kolom gelas vertikal yang diisi serbuk kalsium karbonat. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk
memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Mikhail Tswett yang diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi Dong, 2006; De
Lux, 2004; Grob dan Barry, 2004. Kromatografi merupakan teknik pemisahan campuran menggunakan fase
diam dan fase gerak. Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen campuran dengan laju yang berbeda, sehingga terjadi
pemisahan karena pembedaan daya adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau muatan ion.
Berdasarkan fase gerak, kromatografi dikelompokkan menjadi dua jenis, yaitu: Kromatografi Gas dan Kromatografi Cair. Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi merupakan salah satu jenis Kromatografi Cair Dong, 2006; De Lux, 2004; Grob dan Barry, 2004.
2.5.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
Kromatografi cair kinerja tinggi KCKT merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam
teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam.
Universitas Sumatera Utara
KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran Ditjen POM, 1995.
KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang antara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik,
maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian impurities dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap nonvolatil. KCKT paling sering
digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis,
menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain. Kelebihan KCKT antara lain:
a. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran b. Resolusinya baik
c. Mudah melaksanakannya d. Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi
e. Dapat dihindari terjadinya dekomposisikerusakan bahan yang dianalisis f. Dapat digunakan bermacam-macam detektor
g. Kolom dapat digunakan kembali h. Mudah melakukan rekoveri cuplikan
i. Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan reprodusibilitasnya lebih baik
j. Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif
Universitas Sumatera Utara
k. Waktu analisis umumnya singkat l. Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar
m. Ideal untuk molekul besar dan ion Putra, 2007 Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali
jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa MS. Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh
Munson, 1991.
2.5.1.1 Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solute atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solute ini melewati suatu
kolom kromatografi. Pemisahan solute ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara
tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran
sampel Rohman, 2007.
2.5.2 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
1. Wadah Fase Gerak Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan yang
umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung wadah harus lebih besar dari 500 ml, yang dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir
yang umumnya 1-2 mlmenit.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2.3 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT 2. Pompa
Untuk mengerakkan fase gerak melalui kolom diperlukan pompa. Pompa harus mampu menghasilkan tekanan 6000 psi pada kecepatan alir 0,1–10mlmenit.
Pompa ada 2 jenis yaitu pompa volume konstan dan pompa tekanan konstan. Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap semua pelarut. Bahan yang umum
digunakan adalah gelas baja antikarat dan teflon. Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor.
3. Injektor Cuplikan harus dimasukkan kedalam pangkal kolom kepala kolom,
diusahakan agas sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu:
a. Hentikan aliranstop flow: aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan
karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi. b. Septum: injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama dengan
yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja
Universitas Sumatera Utara
sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut- pelarut kromatografi cair. Disamping itu, partikel kecil dari septum yang terkoyak
akibat jarum injektor dapat menyebabkan penyumbatan. c. Katup putaran loop valve: ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 2, tipe
injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar daripada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara otomatis dengan adaptor khusus,
volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual. Pada posisi LOAD, sampel loop cuplikan dalam putaran diisi pada tekanan
atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.
Gambar 2.4 Skema Penyuntikan Sampel Metode Valve 4. Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom
dapat dibagi menjadi dua kelompok: 1. Kolom analitik: diameter khas adalah 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada
jenis kemasan. Untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm. Untuk kemasan mikropartikel berpori, umumnya 10-30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
Universitas Sumatera Utara
2. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25-100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi,
terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom tergantung pada mode KCKT yang digunakan.
5. Detektor Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan
dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan noise yang rendah, kisar respons linier yang
luas, dan memberi tanggapanrespon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi
tidak selalu dapat diperoleh. Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern
kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi popular
karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan, terutama
dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detector spektrofotometer UV. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor
ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan. 6. Pengolahan Data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.
Universitas Sumatera Utara
Kegunaan kromatogram: 1. Kualitatif
Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif Luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan dapat
digunakan untuk menghitung konsentrasi. 3. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan dan
kinerja kolom kapasitas ‘k’, selektifitas ‘ ’
, jumlah pelat teoritis ‘ N’
, jarak setara dengan pelat teoritis ‘HETP’ dan resolusi ‘R’.
7. Fase Gerak Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel Johnson dan Stevenson, 1991. Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu variabel
yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat yang
diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak.
Fase gerak harus:
a. Murni; tidak ada pencemarkontaminan
b. Tidak bereaksi dengan pengemas
c. Sesuai dengan detektor
d. Melarutkan cuplikan
Universitas Sumatera Utara
e. Mempunyai viskositas rendah
f. Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan
g. Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas
Umumnya, pelarut-pelarut dibuang setelah digunakan karena prosedur pemurnian kembali membosankan dan mahal. Dari semua persyaratan di atas, 4
persyaratan pertama adalah yang paling penting. Gelembung udara degassing yang ada harus dihilangkan dari pelarut, karena udara yang terlarut keluar
melewati detektor dapat menghasilkan banyak gangguan noise sehingga data tidak dapat digunakan Putra, 2007.
Elusi Gradien dan Isokratik
Elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu: 1. Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau
lebih fase gerak dengan perbandingan tetap komposisi fase gerak tetap selama elusi.
2. Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu komposisi fase
gerak berubah-ubah selama elusi. Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak
selama suatu analisis kromatografi berlangsung. Digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran
polaritas yang luas. Pengaruh yang menguntungkan dari elusi gradien adalah memperpendek waktu analisis senyawa-senyawa yang secara kuat ditahan di
dalam kolom Putra, 2007.
Universitas Sumatera Utara
2.5.3 Jenis Kromatografi
