Desain Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian Rancangan penelitian Larutan h-ALA 125 mmolL Sigma Larutan trikloro asetat TCA 60 gL yang mengandung HgCl Analisis Data

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Desain Penelitian

Desain yang digunakan pada penelitian ini adalah studi experimental pada mencit jantan.

3.2. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium terpadu USU, selama 12 minggu.

3.3. Sampel Penelitian

Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan Mus musculus L. strain BALBC, umur 6-7 minggu, dengan kisaran berat badan 30-45gr yang diperoleh dari Balai Penyidikan dan pengujian veteriner BPPV Medan. Sebelum perlakuan mencit terlebih dahulu diaklimatisasi selama seminggu. Mencit dipelihara dalam kandang yang diberi alas sekam dan anyaman kawat sebagai penutup. Pemberian pakan dan minum dilakukan setiap hari secara ad libitum. Pakan yang diberikan berupa pellet produksi PT. Charoen Pokphan Medan dan diberi minum aquadest. Selanjutnya secara acak mencit dimasukkan ke dalam tiap kandang terpisah. Setiap kandang diberi tanda sesuai dengan perlakuan. 3.4. Variabel penelitian

3.4.1. Variabel Independent

1. Pb asetat 2. Berat molekul kitosan 3. Konsentrasi kitosan Emni Purwoningsih : Pengaruh Berat Molekul Kitosan Terhadap Kadar Plumbum Pb Darah Dan Aktivitas…, 2008 USU e-Repository © 2008 37

3.4.2. Variabel Dependent

1. Aktivitas enzim DALAD 2. Kadar Pb darah 3. Kadar Hb

3.5. Rancangan penelitian

Pada penelitian ini sampel terdiri dari 30 ekor mencit yang dibagi secara acak dalam 10 kelompok masing-masing 3 ekor tiap kelompok dengan kode sebagai berikut: K0 = 0,01LKgBB aqudest kontrol K1 = 25mgKgBB Pb asetat +0,01 LKgBB aqudest kontrol larutanPb K2 = 0,01 LKgBB aqudest LM 1 kontrol kitosan K3 = 0,01 LKgBB asetat kontrol asetat P1 = larutan Pb+ larutan kitosan LM1 P2 = larutan Pb+ larutan kitosan LM2 P3 = larutan Pb+ larutan kitosan MM1 P4 = larutan Pb+ larutan kitosan MM2 P5 = larutan Pb+ larutan kitosan HM1 P6 = larutan Pb+ larutan kitosan HM2 Jumlah ulangan tiap kelompok Penentuan jumlah ulangan untuk tiap kelompok berdasarkan rumus dari Federer 1963, yaitu : t - 1 n - ≥ 15 t = jumlah perlakuan n = jumlah ulangan Jumlah perlakuan dalam penelitian ini adalah 8, maka jumlah ulangan tiap kelompok adalah 3. Emni Purwoningsih : Pengaruh Berat Molekul Kitosan Terhadap Kadar Plumbum Pb Darah Dan Aktivitas…, 2008 USU e-Repository © 2008 38

3.6. Pelaksanaan Penelitian

Perlakuan dimulai dengan menimbang berat badan masing-masing mencit dan diberi perlakuan sesuai dengan kelompok perlakuan. Bahan uji diberikan secara oral dengan menggunakan sonde yaitu alat suntik dengan jarum yang berujung tumpul sedikit membendol pada ujungnya. Jarum tumpul tersebut dimasukkan dengan hati-hati kira-kira sampai di lambung, setelah itu bahan uji dipompakan keluar. Volume pemberian bahan adalah 0,01LKg BB setiap hari selama 14 hari. Kitosan yang diberikan ke mencit dalam bentuk larutan dengan pelarut asam asetat 1 dengan berat molekul rendah bersumber dari udang, molekul sedang bersumber dari kepiting dan molekul tinggi bersumber dari blankas. Konsentrasi larutan kitosan 1 dan 2, untuk menjaga kesetabilan viskositas larutan maka larutan kitosan dibuat setiap pemberian perlakuan. Satu hari setelah selesai perlakuan berat badan mencit ditimbang dan dimatikan secara dislokasi leher dan dibedah untuk diambil darahnya sebanyak 5 mL selanjutnya dianalisa kadar Pb dalam darah, aktivitas enzim -ALAD, dan kadar Hemoglobin.

3.6.1. Prosedur Pemeriksaan

Adapun prosedur pemeriksaan akan dilakukan penahapan sebagai berikut : Alat dan Bahan Pengambilan sampel darah dilakukan dari jantung. Adapun alat dan bahan yang digunakan adalah : spuit 5 cc, tabung yang berisi heparin 0,01 mg sebagai antikoagulan. Cara Kerja Emni Purwoningsih : Pengaruh Berat Molekul Kitosan Terhadap Kadar Plumbum Pb Darah Dan Aktivitas…, 2008 USU e-Repository © 2008 39 Darah diambil sebanyak 5 ml dengan menggunakan spuit, dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi heparine dan disimpan pada suhu 4 C Wigfield Farant,

1981. 3.6.2. Pembuatan larutan pereaksi untuk analisis enzim

δ-ALAD Alat dan bahan Alat yang digunakan dalam pembuatan larutan pereaksi yaitu: timbangan analitik; labu ukur 100 ml, , pH meter, gelas piala 250 ml, batang pengaduk, gelas ukur 50 ml dan 100 ml. Bahan kimia yang digunakan adalah: Na 2 HPO 4. 12H 2 O; NaH 2 PO 4. 2H 2 O, -ALA; trikloro asetat TCA, HgCl 2 , Triton X-100, p-dimethylaminobenzaldehyd, asam asetat glacial, asam perklorat, aquades. Cara kerja a. Larutan triton x-100 Sebanyak 0,5 mL triton x-100 dicampur dengan 500 mL aquades. b. Larutan buffer natrium fosfat 0,2 molL pH 6,4 Sebanyak 53,72 g Na 2 HPO 4. 12H 2 O ditimbang dilarutkan dalam mL 500 mL aquades hingga 100 mL Larutan A. NaH 2 PO 4. 2H 2 O 23,4 g dilarutkan dalam 500 mL aquades Larutan B.Selanjutnya 100 mL Larutan A dicampur dengan 168 mL Larutan B, dilakukan pengukuran pH dengan menggunakan pH meter. Jika pH menunjukkan lebih besar dari 6,4, maka larutan ditambahkan asam fosfat sedikit demi sedikit hingga pH 6,4. sedang jika pH lebih rendah dari 6,4, maka larutan ditambah dengan larutan Na 2 PO 4.

c. Larutan h-ALA 125 mmolL Sigma

Emni Purwoningsih : Pengaruh Berat Molekul Kitosan Terhadap Kadar Plumbum Pb Darah Dan Aktivitas…, 2008 USU e-Repository © 2008 40 Sebanyak 209,5 mg -ALA dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml., dilarutkan dengan aquades hingga 100 mL, dikocok hingga homogen, dan disimpan pada suhu 4 C.

d. Larutan trikloro asetat TCA 60 gL yang mengandung HgCl

2 60 mmolL Sebanyak 15 g TCA dan 4 g HgCl 2 dimasukkan ke dalam gelas piala dan ditambah dengan aquades sampai volumenya 250 mL.

e. Larutan pereaksi ehrlich

Sebanyak 2,0 g p-dimethylaminobenzaldehyd ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 60 ml asam asetat glasial. Selanjutnya ditambahkan 32 ml asam perklorat 70. Sambil diaduk, tambahkan asam asetat sampai tepat 100 ml Wigfield Farant, 1981. Emni Purwoningsih : Pengaruh Berat Molekul Kitosan Terhadap Kadar Plumbum Pb Darah Dan Aktivitas…, 2008 USU e-Repository © 2008 41

3.6.3. Prosedur penentuan aktivitas enzim h-ALAD dalam darah

Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penentuan aktivitas enzim -ALAD adalah: tabung mikro, mikro pipet, inkubator, sentrifugator dan spektrofotometer . Bahan-bahan yang digunakan adalah: sampel darah, aquades, triton x-100, larutan buffer natrium fosfat 0,2 moll pH 6,4, larutan -ALA 125 mmolL, larutan trikloro asetat TCA 60 gL yang mengandung HgCl 2 60 mmolL ,larutan pereaksi ehrlich. Cara kerja Pipet 20 μL sample darah dengan mikropipet, dimasukkan dalam tabung mikro tambahkan 100 μL larutan Triton X-100 campur selama 15 detik dan tempatkan campuran dalam ice-bath selama 3 menit untuk menyempurnakan lisis. Ke dalam hemolisat ditambahkan 100 μL buffer natrium fosfat pH 6,4 dan 100 μL larutan δ- Aminolevulinic acid kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 C. Untuk blanko tambahkan 200 μL campuran larutan TCA merkuri klorida. Inkubasi semua sample selama 60 menit pada suhu 37 C. Untuk mengakhiri inkubasi hentikan reaksi dengan menambahkan 200 μL campuran larutan TCA merkuri klorida. Sentrifugasi pada kecepatan 11500 rpm selama 5 menit pada eppendorf microcentrifuge. Setelah disentrifugasi pindahkan 400 μL larutan supernatan ke tabung lain dan tambahkan 400 μL pereaksi Ehrlich. Selanjutnya untuk blanko ditambahkan 400 μL pereaksi Ehrlich dan 400 μL aquadest. Setelah 5 menit, absorbansi diukur pada panjang gelombang 555 nm Wigfield Farant, 1981. 3.6.4. Penentuan Kadar Pb dalam Darah Emni Purwoningsih : Pengaruh Berat Molekul Kitosan Terhadap Kadar Plumbum Pb Darah Dan Aktivitas…, 2008 USU e-Repository © 2008 42 Alat dan Bahan Alat yang digunakan: tabung reaksi; hote plate, pipet ukur 1,0 ml; spektrofotometer serapan atom Shimaddzu 650. Bahan yang digunakan: sampel darah; larutan asam nitrat pekat; larutan asam nitrat 13. Cara Kerja Sebanyak 0,5 ml darah dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan asam nitrat pekat kurang lebih 1 ml. Selanjutnya dipanaskan secara perlahan-lahan ke atas hote plate sampai tidak terjadi busa dan larutan bewarna kuning. Pemanasan dilanjutkan sampai kering dengan baik di atas hote plate. Kemudian tambahkan asam nitrat 13. Kemudian larutan diukur dengan spektrofotometer serapan atom AAS Simadzu AA 6200 pada panjang gelombang 283,3nm.

3.6.5. Penentuan Hematokrit

Digunakan untuk menentukan aktivitas enzim -ALAD. Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan adalah: pipet hematokrit, malam waxlilin. Emni Purwoningsih : Pengaruh Berat Molekul Kitosan Terhadap Kadar Plumbum Pb Darah Dan Aktivitas…, 2008 USU e-Repository © 2008 43 Cara Kerja Sample darah dimasukkan ke dalam pipet hematokrit hingga hampir penuh, kedua ujung pipet ditutup dengan lilin dan kemudian disentrifuge pada kecepatan 16.000 rpm, selama 5 menit. Persentase hematokrit dibaca pada skala khusus.

3.6.6. Penentuan Kadar Hemoglobin

Kadar hemoglobin diukur dengan metode cyanmethemoglobin. Alat dan Bahan Alat yang digunakan: mikropipet, spektofotometer. Bahan yang digunakan: sampel darah, reagents untuk menentukan konsentrasi hemoglobin Biosistem reagent intrumen. Cara kerja Preparasi reagents: satu mL reagents ditambah 49 mL air suling, diaduk dan dimasukkan ke dalam botol cokelat, di simpan pada suhu 15-30 C dapat stabil dalam 6 hari. Dimasukkan darah sampel 10µL ke dalam tabung A, standard 10µL ke dalam tabung B. Pada masing-masing tabung ditambahkan reagents 25 mL. Untuk blank dimasukkan reagents 25 mL ke tabung C. Setelah itu semua tabung di vortex dan tunggu sampai 3 menit pada suhu ruangan. Setelah 3 menit tiap larutan di masukkan ke cuvets, larutan blanko di masukkan ke dalam spektrophotometer untuk dibaca nilai absorbansinya pada panjang gelombang 540nm. Kemudian dilanjutkan dengan pembacaan standard dan terakhir dilakukan pembacaan absorbansi sampel. Emni Purwoningsih : Pengaruh Berat Molekul Kitosan Terhadap Kadar Plumbum Pb Darah Dan Aktivitas…, 2008 USU e-Repository © 2008 44 3.7. Variabel yang diamati 3.7.1. Keaktivan enzim h-ALAD Keaktivan enzim dinyatakan dalam mikromolekul porfobilinogen PBG per jam per liter eritrosit yang dihitung dengan rumus: Absorbansi X 109,4 X1,00 µmol PBG jam1 eritrosit Hematokrit

3.7.2. Kadar Pb dalam Darah

Kadar Pb dalam darah dinyatakan dalam µg 100 mL darah. Pada alat AAS Langkah-langkah Pengoperasian AAS Simadzu AA 6200, angka yang dibaca pada recorder menunjukkan harga konsentrasi. Sampel darah yang dianalisis kadar Pbnya sebanyak 0,5 ml. Pada waktu pengukuran, volume ditepatkan menjadi 1,0 ml, maka kadar Pb dalam darah adalah: 1 X konsentrasi yang dibaca 0,5

3.7.3. Kadar Hb dalam darah

Untuk mendapatkan konsentrasi Hb maka dihitung dengan rumus: A sampel x 37,5 = C sampel Keterangan: A= nilai absorbansi C= konsentrasi Emni Purwoningsih : Pengaruh Berat Molekul Kitosan Terhadap Kadar Plumbum Pb Darah Dan Aktivitas…, 2008 USU e-Repository © 2008 45

3.8. Analisis Data

Data yang diperoleh akan dianalisa dengan program komputer SPSS 13. Dicari apakah ada perbedaan kadar Pb darah, aktivitas enzim -ALAD, dan kadar Hb antara kelompok perlakuan dengan kontrol dengan menggunakan uji Analisa Varian Anova. Jika dengan uji tersebut terdapat perbedaan yang nyata maka dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil pada tingkat kemaknaan p 0,05. Emni Purwoningsih : Pengaruh Berat Molekul Kitosan Terhadap Kadar Plumbum Pb Darah Dan Aktivitas…, 2008 USU e-Repository © 2008 46

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian

Pada bagian ini dipaparkan hasil penelitian yang diperoleh dari hasil pengukuran terhadap variabel bebas dan terikat. Tujuannya adalah untuk mengetahui pengaruh kitosan terhadap kadar plumbum darah dan aktivitas enzim δ-ALAD. Berdasarkan hasil pengukuran diperoleh data sebagai berikut.

4.1.1. Kadar Hemoglobin

Kadar hemoglobin diukur untuk mengetahui apakah ada pengaruh pemberian kitosan dari beberapa berat molekul,yaitu molekul rendahLM=400Kda yang bersumber dari kulit udang, molekul sedang MM=400-800Kda bersumber dari kepiting, dan molekul tinggi HM= ≥900KDa bersumber dari blangkas, terhadap kadar hemoglobin darah mencit yang diberi Pb asetat secara oral selama 14 hari. Dari perhitungan didapat kadar hemoglobin darah mencit pada kelompok kontrol berbeda nyata p0,05 jika dibandingkan dengan kelompok perlakuan. Pada kelompok kontrol kadar hemoglobin rata-rata pada K1 kontrol Pb berbeda signifikan jika dibandingkan dengan K0 kontrol aqua, K2 kontrol kitosan dan K3 kontrol asetat serta berbeda nyata jika dibandingkan dengan kelompok perlakuan. Kadar hemoglobin rata-rata K3 juga berbeda nyata dengan seluruh kelompok kontrol dan kelompok perlakuan. Data kadar hemoglobin rata-rata dari kelompok kontrol dan perlakuan dapat dilihat dari tabel 4 berikut. Emni Purwoningsih : Pengaruh Berat Molekul Kitosan Terhadap Kadar Plumbum Pb Darah Dan Aktivitas…, 2008 USU e-Repository © 2008 47