berupa plasmid DNA pHIS tanpa gen HIV-1 serta booster berupa virus Fowlpox FPV tanpa sisipan gen HIV -1. Vaksin diaplikasikan melalui rute intramuskular.
Seluruh regimen vaksin yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari tim peneliti Laboratorium Vaksin HIV, Departemen Mikrobiologi dan Imunologi,
University of Melbourne, Australia yang dipimpin oleh Dr. Stephen J. Kent, MD, MBBS, FRACP.
3.4. Reagensia dan Bahan Habis Pakai
Larutan penyangga borat, larutan penyangga PBS phosphate buffer saline, Tween-20, susu tanpa lemak, air tanpa ion, protein p24 HIV-1, kontrol
protein, goat anti-monkey IgG yang dikonjugasikan dengan peroksidase, substrat TMB 3-3-5-5-tetramethylbenzidine, larutan penyangga phosphate citrate buffer,
H
2
SO
4
, jarum suntik, tabung hampa udara berheparin, 96 well ELISA plate.
3.5. Alat
Alat yang digunakan adalah sentrifuse, penangas air 56 °
C, lemari pendingin suhu 4
° C dan suhu -70
° C, ELISA microplate reader, microplate
washer, micropipettor, biosafety cabinet, pipette tips, vortex, inkubator 37 °
C.
3.6. Metode Penelitian
Seluruh pelaksanaan kegiatan penelitian secara etika dan moral telah memperoleh persetujuan etik dari Komisi Pengawasan Kesejahteraan dan
Penggunaan Hewan Penelitian PSSP-LPPM IPB Animal Care and Use Committee, Primate Research Center-Bogor Agricultural University dengan
nomor persetujuan 03-003-OR tahun 2003 Lampiran 1. Penelitian terdiri dari program vaksinasi, koleksi sampel dan uji ELISA.
Gambar 6. Skema desain penelitian disajikan secara ringkas dalam gambar
3.6.1. Program Vaksinasi
Empat belas ekor beruk dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok A kelompok hewan yang divaksinasi dan kelompok B kelompok kontrol. Masing-
masing kelompok terdiri dari tujuh ekor dengan nomor identifikasi tato tertera pada Tabel 2.
Tabel 2. Daftar Identitas Macaca nemestrina nomor tato kelompok A kelompok
yang divaksinasi dan kelompok B kelompok kontrol
Kelompok A Kelompok B
5294 5364
5375 5395
5421 5598
5716 5053
5169 5176
5284 5424
5607 5715
Kelompok A diimunisasi dengan vaksin DNA HIV-1 melalui metode priming DNA HIV-1 dan boosting dengan rFPV-HIV, sedangkan kelompok B
merupakan kelompok kontrol yang diberi placebo. Jadwal vaksinasi pada kedua kelompok dituliskan pada Tabel 3 dibawah ini.
Tabel 3. Jadwal vaksinasi priming dan boosting pada hewan kelompok A dan B
Minggu ke- 0 Minggu ke-4
Minggu ke-8 Minggu ke- 12
Minggu ke-16 Kelompok A
DNA HIV-1 DNA HIV-1
DNA HIV-1 Booster I rFPV
Booster II rFPV Kelompok B
Plasmid DNA Plasmid DNA
Plasmid DNA FPV
FPV
3.6.2. Koleksi Sampel
Dilakukan pengambilan darah dengan venesectio pada vena femoralis. Jadwal koleksi sampel disajikan pada Tabel 4. Hewan terlebih dahulu dianastesi
dengan injeksi Ketamin 10-20 mgkg BB secara intramuskular. Setelah hewan teranastesi, darah diambil dan dimasukkan ke tabung hampa udara dengan anti
koagulan heparin. Selanjutnya darah di sentrifugasi dengan kecepatan 400 x g gravitasi.
Proses sentrifugasi akan memisahkan plasma dari bagian darah lainnya,
sehingga terbentuk endapan dan supernatan. Supernatan merupakan plasma yang akan digunakan untuk uji. Sebelum diuji, plasma diinaktivasi dengan
pemanasan pada suhu 56 °
C selama tiga puluh menit. Jika sampel tidak langsung digunakan dapat disimpan pada suhu -70
° C untuk selanjutnya
digunakan dalam uji ELISA.
Tabel 4. Jadwal pengambilan darah yang digunakan untuk uji ELISA
Pengambilan Darah Kelompok A
Kelompok B I Minggu 0
Pre-vaksinasi Pre-vaksinasi
II Minggu ke-12 Boosting pertama dengan rFPV
yang mengekspresikan gen HIV-1
FPV tanpa gen HIV-1
III Minggu ke-14 Dua minggu pasca boosting
pertama Dua minggu pasca FPV
IV Minggu ke -16 Boosting kedua dengan rFPV
yang menge kspresikan gen HIV-1
FPV tanpa gen HIV-1
V Minggu ke-18 Dua minggu pasca boosting
kedua Dua minggu pasca FPV
VI Minggu ke -20 Empat minggu pasca boosting
kedua Empat minggu pasca FPV
Secara sekuensial jadwal vaksinasi dan pengambilan darah disajikan pada gambar 5.
o o o o o o o o
o o o o o o
0 4 5 8 9 12 13 14 16 17 18 20 21 22
minggu
↑ ↑
↑ ↑
↑ ↑
⇓ ⇓
⇓ ⇓
⇓ ⇓
Keterangan :
↑ ↑
: Vaksinasi DNA HIV-1 Plasmid DNA : Booster rFPV -HIV FPV
⇓
: Koleksi sampel darah untuk ELISA
Gambar 7. Jadwal vaksinasi dan pengambilan darah disajikan secara sekuensial
3.6.3. Enzyme-linked Immunosorbent Assay ELISA
Uji ELISA yang dilakukan pada penelitian ini adalah ELISA tipe tidak langsung untuk mendeteksi ada tidaknya antibodi terhadap HIV-1 protein p24
yang merupakan protein komponen inti capsid HIV-1. Sebanyak 2
µ gml protein p24 HIV-1 dalam larutan penyangga Borat
digunakan untuk melapisi tiap sumur dari lempeng ELISA 96-well. Sebagai kontrol background digunakan protein yang berasal dari sel tidak terinfeksi
tempat ditumbuhkannya p24 HIV dengan konsentrasi yang sama. Setiap sumur pada lempeng dilapis dengan antigen p24 dan kontrol p24 sebanyak 50
µ l.
Selanjutnya dilakukan inkubasi 18 jam pada suhu 4 °
C. Kemudian dilakukan pencucian dengan PBS-Tween 0.05 menggunakan ELISA microplate washer
yang dilanjutkan dengan blocking selama dua jam pada suhu 37 °
C menggunakan larutan penghambat berupa susu tanpa lemak 5 dalam PBS-
Tween 0.05 dan setelah itu dicuci kembali. Tujuan blocking adalah mencegah terjadinya ikatan antara lempeng dengan protein asing yang dapat mengganggu
hasil uji. Sebanyak 50
µ l perbandingan 1:400 dalam larutan penghambat plasma
M.nemestrina, kontrol positif antibodi p24 HIV, kontrol negatif p24 HIV dimasukkan ke dalam setiap sumur dan diinkubasi selama 90 menit pada suhu
37 °
C. Sebanyak empat sumur tidak diberi penambahan sampel oleh karena optical density OD yang dihasilkan aka n digunakan sebagai kontrol konjugat
dalam analisis hasil. Setelah pencucian, dimasukkan ke dalam masing-masing sumur sebanyak
50 µ
l konjugat goat anti-monkey IgG peroxidase dengan pengenceran 1:1000
dalam larutan penghambat. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 °
C selama 60 menit dan diikuti dengan pencucian menggunakan PBS-Tween 0,05.
Tahap akhir uji adalah penambahan substrat berupa TMB yang dilarutkan dalam Phosphate Citrate Buffer sebanyak 50
µ l pada setiap sumur dalam kondisi
gelap selama 20 menit. Penghentian reaksi dilakukan dengan penambahan larutan H
2
SO
4.
Substrat akan bereaksi dengan ensim peroksidase sehingga chromogen yang dikandung substrat tersebut teroksidasi menghasilkan warna
yang akan dibaca dengan alat ELISA microplate reader pada panjang gelombang 450nm. Hasil pembacaan berupa nilai kepadatan optik OD sebagai data
numerik yang mempresentasikan kadar antibodi dalam sampel.
3.6.4. Analisis Hasil ELISA
Untuk mendapatkan nilai kepadatan optik atau Optical Density OD yang sesungguhnya digunakan formulasi yang merupakan standar penghitungan
empirik di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, PSSP LPPM-IPB, disajikan dalam tabel 5 dibawah ini.
Tabel 5. Rumus perhitungan ni lai Optical Density OD
OD konjugat kontrol = OD p24 – OD kontrol p24 pada sumur tanpa sampel OD sampel = OD sampel pada p24 – OD s ampel pada kontrol p 24 –
OD konjugat control
Analisis hasil diamati secara metode deskriptif dengan menggunakan tabel dan grafik yang menyajikan nilai OD sesungguhnya dari setiap sampel asal
hewan coba maupun nilai rataannya.
IV. HASIL PENELITIAN
