Alat-alat Bahan-bahan Bagan Skrining Fitokimia Bagan Penelitian

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat-alat

1. Gelas ukur 100 mL 10 mL Pyrex 2. Gelas beaker 250 mL 1000 mL Pyrex 3. Gelas erlenmeyer 500 mL 100 mL Pyrex 4. Corong kaca 5. Corong pisah 500 mL Pyrex 6. Ekstraktor 5000 mL Schoot Duran 7. Tabung reaksi Pyrex 8. Pipet tetes 9. Pipa kapiler 10. Spatula 11. Rotarievaporator Bűchi R-114 12. Labu rotarievaporator 1000 mL 13. Labu didih 1000 mL Schoot Duran 14. Labu takar 250 mL Pyrex 15. Kolom kromatografi Pyrex 16. Botol vial 17. Neraca analitis Mettler AE 200 18. Lampu UV 254 nm 356 nm UVGL 58 19. Statif dan klem 20. Penangas air 21. Alat destilasi 22. Bunsen 23. Bejana Kromatografi Lapis Tipis 24. Bejana Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 25. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu Universitas Sumatera Utara 26. Spektrofotometer UV-Visible 27. Spektrometer 1 H-NMR JeolDelta2NMR 500MHz

3.2 Bahan-bahan

1. Daun tumbuhan Balik Angin M.recurvata Gage. 2. Metanol Destilasai 3. N-heksana Teknis 4. Etil asetat Teknis 5. Aquadest 6. Kloroforom Teknis 7. Benzena p. a. E. Merck 8. Eter p. a. E. Merck 9. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KGaA 10. FeCl 3 5 11. NaOH 10 12. Mg-HCl 13. H 2 SO 4P 14. HCl 2N 15. Plat KLT Merck Kieselgel 60 F 254 16. Plat KLT Preparatif Merck Kieselgel 60 F 254 17. Pereaksi Benedict

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan balik angin M.recurvata Gage. yang diperoleh dari daerah Sunggal, Sumatera Utara. Daun tumbuhan balik angin dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun balik angin sebanyak 1400 g. Universitas Sumatera Utara

3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Balik Angin

Serbuk daun tumbuhan balik angin diidentifikasikan dengan menggunakan cara: 1. Skrining Fitokimia 2. Analisis Kromatografi Lapis Tipis

3.3.2.1 Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun tumbuhan balik angin maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut: - Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun tumbuhan balik angin M.recurvata Gage. yang telah dikeringkan dan dipotong kecil-kecil ke dalam erlenmeyer - Ditambahkan metanol ± 100 mL - Didiamkan - Disaring - Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi: a. Tabung I : dengan FeCl 3 5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda c. Tabung III : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru violet d. Tabung IV : dengan H 2 SO 4p menghasilkan larutan orange kekuningan

3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah campuran n-heksana:etil asetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10 v v ⁄ , 80:20 v v ⁄ , 70:30 v v ⁄ dan 60:40 v v ⁄ . Universitas Sumatera Utara Dimasukkan 10 mL larutan fase gerak n-heksana:etil asetat 90:10 v v ⁄ kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl 3 5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n- heksan: etil asetat dengan perbandingan 80:20 v v ⁄ , 70:30 v v ⁄ dan 60:40 v v ⁄ .

3.3.3 Memperoleh Ekstrak Pekat Metanol dari Daun Tumbuhan Balik Angin M.recurvata Gage.

Serbuk daun tumbuhan balik angin ditimbang sebanyak 1400 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 3 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ± 48 jam dan diulangi sebanyak 4 kali. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut menguap. Lalu dilakukan pemblokan tanin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat dan disaring. Filtrat kemuadian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana lalu diuapkan hingga pekat sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol sebanyak 12,06 g.

3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10 v v ⁄ , 80:20 v v ⁄ , 70:30 v v ⁄ dan 60:40 v v ⁄ . Universitas Sumatera Utara Kolom I : Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan 370 g silika gel dengan menggunakan n-heksana, diaduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 12,06 g ekstrak pekat metanol daun tumbuhan balik angin kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat 90:10 v v ⁄ secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fase gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20 v v ⁄ , 70:30 v v ⁄ dan 60:40 v v ⁄ . Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 12 mL lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama. Kolom II: Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan 70 g silika gel dengan menggunakan kloroform, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan kloroform 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 2,48 g fraksi hasil penggabungan kolom I kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel lalu ditambahkan fasa gerak kloroform : metanol 90:10 v v ⁄ secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial sebanyak 5 mL lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama. Diuapkan sampai terbentuk kristal.

3.3.5 Pemutusan Gula dari Senyawa Flavonoida

Pemutusan gula dari senyawa flavonoida dilakukan dengan cara hidrolisis asam menggunakan HCl 2N sambil dipanaskan kemudian dipartisi dengan kloroform. Universitas Sumatera Utara Senyawa yang diperoleh dari kolom kromatografi dilarutkan dengan metanol kemudian dihidrolisa dengan menggunakan HCl 2N lalu dipanaskan selama ± 45 menit dan disaring. Filtrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan kloroform secara berulang-ulang. Lapisan kloroform diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 0,17 g.

3.3.6 Pemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Pemurnian senyawa flvonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif dilakukan karena hasil analis KLT dari kristal yang diperoleh dengan kromatografi kolom menunjukkan hasil yang belum murni. Ekstrak pekat kloroform dilarutkan kembali dengan kloroform lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai untuk Kromatomatografi Lapis Tipis Preparatif. Benzene : eter 80:20 v v ⁄ adalah fasa gerak yang menunjukkan pemisahan paling baik untuk selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana KLT preparatif. Selanjutnya kristal yang telah dilarutkan tadi ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Plat dimasukkan kedalam bejana berisi pelarut yang telah dijenuhkan kemudian ditutup. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan digerus dari plat lalu dielusi dengan metanol 100. Hasil elusi diuapkan hingga terbentuk kristal.

3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi

3.3.7.1 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis

Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat 60:40 v v ⁄ , kloroform : metanol 90:10 v v ⁄ dan benzene : eter 80:20 v v ⁄ . Universitas Sumatera Utara Dimasukkan fasa gerak n-heksana : etil asetat 60:40 v v ⁄ dalam bejana kromatografi lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan kloroform pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas atas plat KLT lalu plat KLT dikeluarkan dari bejana kromatografi, dikeringkan dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl 3 5. Diamati warna noda yang dihasilkan dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan pada fasa gerak kloroform : metanol 90:10 v v ⁄ dan benzene : eter 80:20 v v ⁄ .

3.3.7.2 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Penentuan Titik Lebur

Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan kedalam melting point apparatus lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur.

3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible

Analisis dengan alat spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut.

3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR

Analisis dengan alat spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut. Universitas Sumatera Utara

3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton

1 H-NMR Analisa dengan alat spektrometer 1 H-NMR diperoleh dari Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan CDCl 3 sebagai pelarut.

3.4 Bagan Skrining Fitokimia

Serbuk daun tumbuhan balik angin Macaranga recurvata Gage. diekstraksi maserasi dengan metanol disaring dipekatkan dibagi kedalam 4 tabung reaksi Tabung I Tabung II ditambahkan pereksi FeCl 3 5 diamati perubahan warna Larutan hitam ditambahkan pereaksi NaOH 10 diamati perubahan warna Larutan biru violet Tabung III ditambahkan pereksi Mg-HCl diamati perubahan warna Tabung IV ditambahkan pereksi H 2 SO 4p diamati perubahan warna Larutan merah muda Larutan orange kekuningan positif flavonoida positif flavonoida positif flavonoida positif flavonoida Universitas Sumatera Utara

3.5 Bagan Penelitian

1400 g serbuk daun tumbuhan balik angin Macaranga recurvata Gage. diskrining fitokimima diekstraksi maserasi dengan metanol selama ± 48 jam dilakukan sebanyak 4 kali disaring ekstrak metanol residu diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator ekstrak pekat metanol diuapkan hingga semua metanol menguap dipekatkan dengan rotarievaporator dilarutkan dengan etil asetat disaring residu ekstrak etil asetat diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator ekstrak pekat etil asetat diuapkan hingga semua etil asetat menguap dilarutkan dengan metanol diekstraksi partisi dengan n-heksana sampai bening lapisan metanol diskrining fitokimia diuapkan hingga pekat ekstrak pekat metanol lapisan n-heksana diuji KLT untuk mengetahui eluen yang sesuai pada kromatografi kolom dikolom kromatografi dengan fase diam silika gel dan fase gerak eluen n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 v v , 80:20 v v , 70:30 v v dan 60:40 v v ditampung tiap fraksi dalam botol vial 12 mL dihitung harga Rf digabung fraksi dengan harga Rf yang sama fraksi 1-51 90:10 fraksi 52-112 80:20 fraksi 113-146 70:30 fraksi 147-334 60:40 fraksi 335-461 60:40 diuji FeCl 3 5 hasil negatif diuji FeCl 3 5 hasil positif diuji FeCl 3 5 hasil positif hasil positif diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 hasil positif diuji KLT untuk mengetahui eluen yang sesuai pada kromatografi kolom dikolom kromatografi dengan fase diam silika gel dan fase gerak eluen kloroform : metanol 90 : 10 v v ditampung tiap fraksi dalam botol vial 5 mL dihitung harga Rf digabung fraksi dengan harga Rf yang sama Universitas Sumatera Utara Sambungan Bagan Penelitian fraksi 1-8 fraksi 9-14 fraksi 15-37 fraksi 38-123 diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 hasil negatif hasil positif hasil positif hasil positif dilakukan uji kandungan gula dengan pereaksi benedict + dilarutkan dengan metanol dihidrolisa dengan menggunakan HCl 2N sambil dipanaskan selama ± 45 menit didinginkan disaring ekstrak metanol asam residu diekstraksi partisi dengan kloroform lapisan kloroform residu diskrining fitokimia diuapkan hingga seluruh kloroform menguap ekstrak pekat kloroform dianalisis Kromatografi Lapis Tipis dikromatografi Lapis Tipis Preparatif dengan eluen benzene:eter 80:20 v v dikeringkan digerus dari plat dan dilarutkan dengan metanol disaring senyawa murni diuapkan dianalisis Kromatografi Lapis Tipis diuji titik lebur dianalisis dengan spektrofotometer UV-Visible, spektrofotometer inframerah dan spektrometer 1 H-NMR hasil analisa Universitas Sumatera Utara BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian