BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Alat-alat
1. Gelas ukur 100 mL 10 mL
Pyrex 2. Gelas beaker
250 mL 1000 mL Pyrex
3. Gelas erlenmeyer 500 mL 100 mL
Pyrex 4. Corong kaca
5. Corong pisah 500 mL
Pyrex 6. Ekstraktor
5000 mL Schoot Duran
7. Tabung reaksi Pyrex
8. Pipet tetes 9. Pipa kapiler
10. Spatula 11. Rotarievaporator
Bűchi R-114 12. Labu rotarievaporator
1000 mL 13. Labu didih
1000 mL Schoot Duran
14. Labu takar 250 mL
Pyrex 15. Kolom kromatografi
Pyrex 16. Botol vial
17. Neraca analitis Mettler AE 200
18. Lampu UV 254 nm 356 nm
UVGL 58 19. Statif dan klem
20. Penangas air 21. Alat destilasi
22. Bunsen 23. Bejana Kromatografi Lapis Tipis
24. Bejana Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 25. Spektrofotometer FT-IR
Shimadzu
Universitas Sumatera Utara
26. Spektrofotometer UV-Visible 27. Spektrometer
1
H-NMR JeolDelta2NMR 500MHz
3.2 Bahan-bahan
1. Daun tumbuhan Balik Angin M.recurvata Gage. 2. Metanol
Destilasai 3. N-heksana
Teknis 4. Etil asetat
Teknis 5. Aquadest
6. Kloroforom Teknis
7. Benzena p. a. E. Merck
8. Eter p. a. E. Merck
9. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KGaA
10. FeCl
3
5 11. NaOH 10
12. Mg-HCl 13. H
2
SO
4P
14. HCl 2N 15. Plat KLT
Merck Kieselgel 60 F
254
16. Plat KLT Preparatif Merck Kieselgel 60 F
254
17. Pereaksi Benedict
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan balik angin M.recurvata Gage. yang diperoleh dari daerah Sunggal, Sumatera Utara. Daun tumbuhan balik angin
dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun balik angin sebanyak 1400 g.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Balik Angin
Serbuk daun tumbuhan balik angin diidentifikasikan dengan menggunakan cara: 1. Skrining Fitokimia
2. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
3.3.2.1 Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun tumbuhan balik angin maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut:
- Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun tumbuhan balik angin M.recurvata Gage. yang telah dikeringkan dan dipotong kecil-kecil ke dalam erlenmeyer
- Ditambahkan metanol ± 100 mL - Didiamkan
- Disaring - Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi
- Ditambahkan masing-masing pereaksi: a. Tabung I : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda
c. Tabung III : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru violet d. Tabung IV : dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan orange kekuningan
3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang
digunakan adalah campuran n-heksana:etil asetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10
v v ⁄
, 80:20
v v ⁄
, 70:30
v v ⁄
dan 60:40
v v
⁄
.
Universitas Sumatera Utara
Dimasukkan 10 mL larutan fase gerak n-heksana:etil asetat 90:10
v v
⁄
kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana
yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan
pereaksi FeCl
3
5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-
heksan: etil asetat dengan perbandingan 80:20
v v ⁄
, 70:30
v v ⁄
dan 60:40
v v
⁄
.
3.3.3 Memperoleh Ekstrak Pekat Metanol dari Daun Tumbuhan Balik Angin M.recurvata Gage.
Serbuk daun tumbuhan balik angin ditimbang sebanyak 1400 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 3 L sampai semua sampel terendam dan
dibiarkan selama ± 48 jam dan diulangi sebanyak 4 kali. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak
pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut menguap. Lalu dilakukan pemblokan tanin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil
asetat dan disaring. Filtrat kemuadian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan
metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana lalu diuapkan hingga pekat sehingga diperoleh
ekstrak pekat metanol sebanyak 12,06 g.
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel
dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10
v v ⁄
, 80:20
v v ⁄
, 70:30
v v ⁄
dan 60:40
v v
⁄
.
Universitas Sumatera Utara
Kolom I : Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan 370 g silika gel
dengan menggunakan n-heksana, diaduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana
100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 12,06 g ekstrak pekat metanol daun tumbuhan balik angin kedalam kolom kromatografi yang telah
berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat 90:10
v v
⁄
secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan
kepolaran dengan menambahkan fase gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20
v v
⁄
, 70:30
v v
⁄
dan 60:40
v v
⁄
. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 12 mL lalu di KLT dan digabung fraksi dengan
harga Rf yang sama.
Kolom II: Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan 70 g silika gel
dengan menggunakan kloroform, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan kloroform
100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 2,48 g fraksi hasil penggabungan kolom I kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur
silika gel lalu ditambahkan fasa gerak kloroform : metanol 90:10
v v
⁄
secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama
banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial sebanyak 5 mL lalu di KLT dan digabung fraksi
dengan harga Rf yang sama. Diuapkan sampai terbentuk kristal.
3.3.5 Pemutusan Gula dari Senyawa Flavonoida
Pemutusan gula dari senyawa flavonoida dilakukan dengan cara hidrolisis asam menggunakan HCl 2N sambil dipanaskan kemudian dipartisi dengan kloroform.
Universitas Sumatera Utara
Senyawa yang diperoleh dari kolom kromatografi dilarutkan dengan metanol kemudian dihidrolisa dengan menggunakan HCl 2N lalu dipanaskan selama ± 45
menit dan disaring. Filtrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan kloroform secara berulang-ulang. Lapisan kloroform diuapkan sehingga diperoleh ekstrak
pekat kloroform sebanyak 0,17 g.
3.3.6 Pemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Pemurnian senyawa flvonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif dilakukan karena hasil analis KLT dari kristal yang diperoleh dengan
kromatografi kolom menunjukkan hasil yang belum murni.
Ekstrak pekat kloroform dilarutkan kembali dengan kloroform lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum
sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai untuk Kromatomatografi Lapis Tipis Preparatif. Benzene : eter 80:20
v v
⁄
adalah fasa gerak yang menunjukkan pemisahan paling baik untuk selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana
KLT preparatif. Selanjutnya kristal yang telah dilarutkan tadi ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat KLT yang telah
diaktifkan. Plat dimasukkan kedalam bejana berisi pelarut yang telah dijenuhkan kemudian ditutup. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan
hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan digerus dari plat lalu dielusi dengan metanol 100. Hasil elusi diuapkan hingga terbentuk kristal.
3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi
3.3.7.1 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat 60:40
v v
⁄
, kloroform : metanol 90:10
v v
⁄
dan benzene : eter 80:20
v v
⁄
.
Universitas Sumatera Utara
Dimasukkan fasa gerak n-heksana : etil asetat 60:40
v v
⁄
dalam bejana kromatografi lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan
dengan kloroform pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai
batas atas plat KLT lalu plat KLT dikeluarkan dari bejana kromatografi, dikeringkan dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
5. Diamati warna noda yang dihasilkan dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan
yang sama dilakukan pada fasa gerak kloroform : metanol 90:10
v v
⁄
dan benzene : eter 80:20
v v
⁄
.
3.3.7.2 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan kedalam melting point apparatus lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan
menggunakan metanol sebagai pelarut.
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan
menggunakan metanol sebagai pelarut.
Universitas Sumatera Utara
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analisa dengan alat spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan CDCl
3
sebagai pelarut.
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
Serbuk daun tumbuhan balik angin Macaranga recurvata Gage.
diekstraksi maserasi dengan metanol disaring
dipekatkan dibagi kedalam 4 tabung reaksi
Tabung I Tabung II
ditambahkan pereksi
FeCl
3
5 diamati
perubahan warna
Larutan hitam ditambahkan
pereaksi NaOH 10
diamati perubahan
warna
Larutan biru violet
Tabung III ditambahkan
pereksi Mg-HCl
diamati perubahan
warna Tabung IV
ditambahkan pereksi
H
2
SO
4p
diamati perubahan
warna
Larutan merah muda
Larutan orange kekuningan
positif flavonoida
positif flavonoida
positif flavonoida
positif flavonoida
Universitas Sumatera Utara
3.5 Bagan Penelitian
1400 g serbuk daun tumbuhan balik angin Macaranga recurvata Gage.
diskrining fitokimima diekstraksi maserasi dengan metanol selama ± 48 jam
dilakukan sebanyak 4 kali disaring
ekstrak metanol residu
diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator
ekstrak pekat metanol diuapkan hingga semua metanol menguap
dipekatkan dengan rotarievaporator dilarutkan dengan etil asetat
disaring
residu ekstrak etil asetat
diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator
ekstrak pekat etil asetat diuapkan hingga semua etil asetat menguap
dilarutkan dengan metanol diekstraksi partisi dengan n-heksana sampai bening
lapisan metanol diskrining fitokimia
diuapkan hingga pekat ekstrak pekat metanol
lapisan n-heksana
diuji KLT untuk mengetahui eluen yang sesuai pada kromatografi kolom dikolom kromatografi dengan fase diam silika gel dan fase gerak eluen n-heksana : etil
asetat dengan perbandingan 90:10
v v
, 80:20
v v
, 70:30
v v
dan 60:40
v v
ditampung tiap fraksi dalam botol vial 12 mL dihitung harga Rf
digabung fraksi dengan harga Rf yang sama
fraksi 1-51 90:10
fraksi 52-112 80:20
fraksi 113-146 70:30
fraksi 147-334 60:40
fraksi 335-461 60:40
diuji FeCl
3
5 hasil negatif
diuji FeCl
3
5 hasil positif
diuji FeCl
3
5 hasil positif
hasil positif diuji
FeCl
3
5 diuji
FeCl
3
5 hasil positif
diuji KLT untuk mengetahui eluen yang sesuai pada
kromatografi kolom dikolom kromatografi dengan
fase diam silika gel dan fase gerak eluen kloroform :
metanol 90 : 10
v
v
ditampung tiap fraksi dalam botol vial 5 mL
dihitung harga Rf digabung fraksi dengan harga
Rf yang sama
Universitas Sumatera Utara
Sambungan Bagan Penelitian
fraksi 1-8 fraksi 9-14
fraksi 15-37 fraksi 38-123
diuji FeCl
3
5 diuji
FeCl
3
5 diuji
FeCl
3
5 diuji
FeCl
3
5 hasil negatif
hasil positif hasil positif
hasil positif dilakukan uji kandungan gula dengan
pereaksi benedict + dilarutkan dengan metanol
dihidrolisa dengan menggunakan HCl 2N sambil dipanaskan selama ± 45 menit
didinginkan disaring
ekstrak metanol asam residu
diekstraksi partisi dengan kloroform lapisan kloroform
residu diskrining fitokimia
diuapkan hingga seluruh kloroform menguap ekstrak pekat kloroform
dianalisis Kromatografi Lapis Tipis dikromatografi Lapis Tipis Preparatif dengan eluen benzene:eter 80:20
v v
dikeringkan digerus dari plat dan dilarutkan dengan metanol
disaring
senyawa murni diuapkan
dianalisis Kromatografi Lapis Tipis diuji titik lebur
dianalisis dengan spektrofotometer UV-Visible, spektrofotometer inframerah dan spektrometer
1
H-NMR hasil analisa
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian