BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Alat-alat
1. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu
2. Spektrofotometer
1
H-NMR JeolDelta2NMR 500MHz
3. Spektrofotometer UV-Vis
4. Tabung PerkolasiMaserasi 5000 mL
Schoot Duran 5.
Rotarievaporator Bűchi R-114
6. Labu rotarievaporator
1000 mL Schoot Duran
7. Alat destilasi Ekstraktor
8. Corong pisah
500 mL Pyrex
9. Kolom Kromatografi
10. Botol vial 10 mL
11. Neraca analitis Mettler AE 200
12. Lampu UV 254 nm356 nm
UVGL 58 13. Penangas air
14. Chamber 15. Gelas Ukur
Pyrex 16. Gelas Beaker
Pyrex 17. Gelas Erlenmeyer
Pyrex
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan-bahan
1. Daun Benalu tumbuhan coklat
2. Metanol
Destilasi 3.
Etil asetat Teknis
4. Aquadest
5. N-heksana
Teknis 6.
Kloroform Teknis
7. FeCl
3
5 8.
Pereaksi Benedict 9.
HCl 6 10. Kapas
11. 12.
Silika gel 40 70-230mesh ASTM Plat KLT Silika gel 60 F
254
E.Merck. KgA E.Merck.Art 554
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun benalu pada tumbuhan coklat yang diperoleh dari daerah Jalan Djamin Ginting, KM. 38.7, Deli Serdang, Ketangkuhen,
Sibolangit. Daun benalu dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun benalu sebanyak 1250 g.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Benalu Tumbuhan Coklat
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun benalu tumbuhan coklat maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi
warna sebagai berikut; 10 g serbuk daun benalu tumbuhan coklat yang telah dikeringkan dimasukkan ke dalam dua gelas Erlenmeyer lalu ditambahkan 25 mL
metanol ke dalam gelas Erlenmeyer I dan 25 mL etil asetat ke dalam gelas Erlenmeyer II.
Didekantasi lalu dibagi masing – masing ekstrak sampel ke dalam dua tabung reaksi. Untuk ektask metanol dan etil asetat :
a. Tabung I ekstrak metanol : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam
b. Tabung II ekstrak etil asetat : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam
3.3.3 Ekstraksi Daun Benalu Tumbuhan Coklat
Serbuk daun Benalu ditimbang sebanyak 1250 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 11 L untuk lima kali pengulangan perendaman sampai semua
sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak
pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan tanin dengan cara melarutkan fraksi pekat metanol dengan
etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian di rotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi pekat etil asetat dilarutkan dengan
metanol dan di ekstraksi partisi berulang-ulang dengan n-heksana sampai lapisan n-heksana bening.
Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ektrak
pekat lapisan metanol. Fraksi metanol di uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict, lalu dihidrolisis dengan menggunakan HCl 6 sambil di panaskan
diatas penangas air selama ± 1 jam.
Universitas Sumatera Utara
Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh di ektraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali. Ekstrak kloroform dipekatkan dengan rotarievaporator
dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 0,3 g.
3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fase diam silika gel 60F
254
Merck. Analisis ini bertujuan untuk mencari sistem dan perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom.
Eluen yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 vv.
Dimasukkan 10 ml campuran larutan fase gerak n-heksana: etil asetat 90:10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Di totolkan
ekstrak pekat kloroform pada plat KLT yang telah diaktifkan. sILIKADimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan,
lalu di tutup dan di elusi. Plat yang telah di elusi, di keluarkan dari bejana, lalu di keringkan. Di amati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian difiksasi
dengan pereaksi FeCl
3
5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-
heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20, 70:30, 60:40 vv.
3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fase diam yang digunakan adalah silika gel
40 70-230 mesh ASTM dan fase gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 vv.
Dirangkai alat kromatografi kolom. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga
homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen.
Universitas Sumatera Utara
Dilarutkan 0,3 g ekstrak pekat kloroform dengan pelarut kloroform, kemudian dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika
gel, lalu ditambahkan eluen n-heksana:etil asetat 90:10 vv secara perlahan- lahan dan diatur sehingga aliran eluen yang keluar dari kolom sama banyaknya
dengan penambahan eluen dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan eluen n-heksana:etil asetat
dengan perbandingan 80:20 vv, 70:30 vv, dan 60:40 vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap ± 10 mL, lalu di KLT dan digabung
fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk gum.
3.3.6 Pemurnian
Senyawa yang telah diperoleh dari hasil isolasi dimurnikan dengan cara, gum yang diperoleh dari isolasi dilarutkan kembali dengan etil asetat, diaduk hingga
semua gum larut sempurna. Kemudian ditambahkan N-Heksan secara perlahan- lahan hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian
didekantasi larutan bagian atas. Lalu, dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum. Kemudian dilakukan kembali
kromatografi kolom dengan eluen yang seragam yaitu n-heksana : etil asetat 60:40 vv sehingga diperoleh senyawa murni yang dibuktikan dengan noda tunggal
pada uji KLT.
Universitas Sumatera Utara
3.3.7 Uji kemurnian Hasil isolasi dengan Kromatografi Lapis tipis KLT
Uji kemurnian gum dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fase diam silika gel 60 F
254
dengan eluen n-heksana:etil asetat 6:4 vv, kloroform:etil asetat 7:3 vv, dan kloroform:metanol 8:2 vv.
Dimasukkan 10 mL larutan fase gerak ke dalam bejana lalu dijenuhkan. Ditotolkan gum yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT.
Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi lapis tipis yang telah jenuh. Setelah pelarut fase gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT
dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Vis
Spektrum serapan kandungan tumbuhan dapat diukur dalam larutan yang sangat encer dengan menggunakan pembanding pelarut blanko. Senyawa tanpa warna
diukur pada rentang 200 – 400 nm dan senyawa berwarna pada rentang 200 – 700 nm. Pelarut yang banyak digunakan untuk spektroskopi UV – Vis adalah metanol.
Senyawa hasil isolasi yang bobot molekulnya diketahui, pengukuran intensitas serapan pada panjang gelombang maksimum λ maks dinyatakan sebagai log ϵ,
dengan ϵ = AСl A = absorbansi, C = konsentrasi dalam g moll, l = panjang alur
sel dalam cm, umumnya 1 Harborne, 1987.
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Vis diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong,
Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut Gambar 4.1.
Universitas Sumatera Utara
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Sinar inframerah mempunyai energi yang lebih rendah dari sinar ultraviolet atau sinar tampak, sehingga tebal sel yang dipakai pada spektrofotometer lebih tipis
daripada untuk spektrofotometer lainnya 0,002 mm. Oleh karena tidak ada pelarut yang sama sekali transparan terhadap sinar inframerah, maka sampel dapat
diukur sebagai padatan atau cairan murninya.
Sampel dalam bentuk padat digerus dalam mortir kecil bersama kristal KBr kering dalam jumlah sedikit 0,5-2 mg cuplikan + 100 mg KBr kering.
Campuran tersebut dipres diantara dua skrup Gambar 3.1 memakai kunci, kemudian kedua skrupnya dibuka dan band yang berisi tablet cuplikan tipis
diletakkan di tempat sel spektrofotometer inframerah dengan lubang mengarah ke sumber radiasi Kristianingrum, S. 2013.
Gambar 3.1 Preparasi sampel pada Spektrofotometer Inframerah Kristianingrum, S. 2013
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan KBr Gambar 4.2.
Universitas Sumatera Utara
3.3.8.3Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Preparasi sampel dimulai dengan dimasukan sampel ke dalam suatu wadah berupa tabung gelas yang berbentuk silindris, diletakkan diantara dua kutub magnet.
Sampel dilarutkan dalam pelarut tak mengandung proton seperti CCl4, CDCl3, D2O atau acetonitril dan sejumlah kecil TMS ditambahkan sebagai standar
internal, kemudian dimasukkan kedalam tempat sampel. Sampel kemudian diputar sekitar sumbunya untuk mengusahakan agar semua bagian dari larutan terkena
medan magnet yang sama Kristianingrum, S. 2013.
Analisis dengan alat Spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia Institut Teknologi Bandung ITB dengan menggunakan
Aseton sebagai pelarut Gambar 4.3.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Uji Flavonoida
- ekstraksi dengan pelarut metanol
Serbuk daun benalu tumbuhan coklat
Dendrophthoe flosculosa Danser di ekstraksi dengan metanol
disaring dibagi ke dalam tabung reaksi
Tabung I
ditambahkan pereaksi
FeCl
3
5 diamati
perubahan warna
Larutan Hitam diamati
warna larutan
Positif Fenolik
- ekstraksi dengan pelarut etil asetat
Serbuk daun benalu tumbuhan coklat
Dendrophthoe flosculosa Danser
di ekstraksi dengan etil asetat disaring
dibagi ke dalam tabung reaksi Tabung I
ditambahkan pereaksi
FeCl
3
5 diamati
perubahan warna
Larutan Hitam diamati
warna larutan
Positif Flavonoida
Universitas Sumatera Utara
3.5 Bagan Penelitian
1250 gram serbuk daun benalu coklat Dendrophthoe flosculosa Danser
diuji Flavonoida dimaserasi dengan metanol hingga terendam
didiamkan selama ± 24 jam diulangi sebanyak 5 kali
disaring Ekstrak metanol
diuji dengan FeCl
3
5 dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak pekat metanol diuapkan hingga semua pelarut metanol habis menguap
dilarutkan dengan etilasetat secara berulang-ulang sampai bening disaring
Ekstrak Etilasetat Residu
tanin diuji dengan FeCl
3
5 dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak pekat etilasetat dilarutkan dengan metanol
diekstraksi partisi dengan n-heksana hingga negatif Lapisan metanol
Lapisan n-heksana tidak dilanjutkan
diuji dengan FeCl
3
5 dipekatkan dengan rotarievaporator
dilakukan uji kandungan gula dengan penambahan pereaksi benedict + dihidrolisis dengan HCl 6 sambil dipanaskan selama 60 menit sambil diaduk
didinginkan disaring
Ekstrak metanol asam Residu
diekstraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali Lapisan kloroform
lapisan metanol asam
dipekatkan dengan rotarievaporator Ekstrak pekat kloroform
Sisa Sampel ampas
diuapkan hingga seluruh etilasetat menguap
diuji dengan FeCl
3
5 Negatif
Negatif
Universitas Sumatera Utara
Lanjutan
Ekstrak pekat kloroform diuji dengan FeCl
3
5 diuji Kromatografi Lapis Tipis untuk mengetahui eluen
n-heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50 vv dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel dan fase gerak
eluen n-heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40, 50:50vv ditampung tiap fraksi sebanyak ± 10 mL dalam botol vial
digabung fraksi dengan Rf yang sama diuji Kromatografi Lapis Tipis
fraksi 1-9 90 : 10vv
fraksi 10-31 80 : 20vv
fraksi 32-43 70 : 30vv
fraksi 44-64 60 : 40vv
hasil negatif hasil positif
hasil positif hasil positif
dianalisis Kromatografi Lapis Tipis dengan eluen n-heksana:etil asetat
60:40vv menghasilkan 3 noda dengan harga Rf 0,29; 0,38; 0,46
dikolom kromatografi dengan fase diam silika gel dan fase gerak eluen
n-heksana : etil asetat 60:40 vv
Senyawa hasil isolasi
dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis,
spektrofotometer Inframerah FT-IR, spektrometer
1
H-NMR hasil analisis
diuji Kromatografi Lapis Tipis digabung fraksi dengan Rf yang sama
fraksi 1- 30 60 : 40vv
fraksi 41-60 60 : 40vv
hasil positif harga Rf 0,38
hasil negatif ditampung tiap fraksi sebanyak ± 5 mL
dalam botol vial
fraksi 31- 35 60 : 40vv
hasil positif harga Rf 0,46
fraksi 61-64 60 : 40vv
hasil negatif fraksi 36- 40
60 : 40vv
hasil negatif diuji kemurnian dengan analisis Kromatografi
Lapis Tipis dihasilkan senyawa murni
dianalisis Kromatografi Lapis Tipis dengan eluen
n-heksana:etil asetat 6:4vv menghasilkan 1 noda
dengan harga Rf 0,38 dianalisis Kromatografi
Lapis Tipis dengan kloroform:etil asetat 7:3 vv
menghasilkan 1 noda dengan harga Rf 0,33
dianalisis Kromatografi Lapis Tipis dengan
kloroform:metanol 8:2 vv menghasilkan 1 noda
dengan harga Rf 0,25
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
Kategori