3.3 Isolasi Bakteri Endofit Dari Akar, Batang dan Daun Tanaman
Isolasi bakteri endofit mengikuti metode Radu Kqueen 2002, bagian akar, batang dan daun tanaman sehat yang dikoleksi dari lokasi segera dicuci
untuk menghilangkan kotoran pada permukaan bagian tanaman, selanjutnya dikeringkan, dibungkus dengan kertas koran dan dimasukkan ke dalam kantong
plastik yang sudah disterilisasi dengan alkohol, dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU. Tahap awal isolasi adalah mencuci bagian tanaman
3-5 cm dengan air mengalir selama 20 menit. Permukaan bagian tanaman disterilisasi dengan merendamnya secara berturut-turut dalam larutan etanol
selama 2 menit, larutan sodium hipoklorit selama 5 menit, dan etanol selama 30 detik. Selanjutnya bagian tanaman dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali
dan dikeringkan di dalam cawan petri steril yang telah dilapisi dengan kertas saring steril. Setelah kering, masing-masing bagian tanaman dipotong menjadi 4
bagian dan diletakkan secara horizontal pada permukaan media NA yang telah
dicampurkan dengan antibiotik ketokonazol 0,3 gram100 ml dengan posisi bekas potongan kearah media. Kultur diinkubasi pada suhu ambien selama 1 hari.
Koloni yang muncul dari bagian tanaman sebelah dalam disubkultur ke media NA yang baru sampai didapat biakan murni Lampiran 1. Isolat murni yang diperoleh
disimpan dalam refrigerator untuk uji selanjutnya.
3.4 Isolasi Fungi Patogen dari Akar, Batang dan Daun Tanaman
Isolasi fungi patogen dilakukan dengan metode sterilisasi permukaan bagian tanaman Narayanasamy, 2011 seperti yang terlihat pada Lampiran 2.
Bagian akar, batang dan daun tanaman yang menunjukkan simptom dipotong menjadi empat bagian dan diletakkan pada permukaan media PDA yang telah
dicampurkan dengan antibiotik kloramfenikol 0,3 gram100 ml dengan posisi simptom ke arah media. Kultur diinkubasi pada suhu ambien selama 1 hari.
Koloni yang muncul dari bagian tanaman disubkulturkan ke media PDA yang baru sampai didapat biakan murni. Isolat murni yang diperoleh disimpan untuk uji
selanjutnya.
Universitas Sumatera Utara
3.5 Karakterisasi Bakteri Endofit dan Identifikasi Fungi Patogen
Identifikasi bakteri endofit dilakukan berdasarkan ciri-ciri dan karakter morfologis, secara makroskopis visual maupun mikroskopis. Karakterisasi dan
identifikasi secara visual berdasarkan bentuk, tepi, elevasi dan warna koloni. Isolat-isolat yang diperoleh dikarakterisasi sifat morfologi yang mencakup
pewarnaan Gram, bentuk sel, tepi, elevasi dan warna koloni. Pengamatan sifat biokimia mencakup uji sitrat dengan SCA, uji katabolisme gula dengan TSIA, uji
hidrolisis pati, uji motilitas dengan SIM, uji gelatin dengan nutrien gelatin, dan uji katalase dengan larutan H
2
O
2
3 Lay, 1994. Fungi patogen dikarakterisasi dan identifikasi berdasarkan warna dan bentuk koloni, warna dan bentuk konidia
dengan buku identifikasi fungi Alexopoulus Mims 1979.
3.6 Uji Antagonisme Isolat Bakteri Endofit Terhadap Rhizoctonia solani
Uji antagonisme secara in vitro dalam cawan Petri yang dilakukan berdasarkan metode difusi cakram. Biakan R. solani ditumbuhkan di tengah media PDA + 3
yeast ekstrak. Selanjutnya isolat bakteri endofit yang telah diremajakan diambil secukupnya dengan menggunakan ose, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi
yang berisi 10 ml larutan NaCl 0,9. Suspensi diukur absorbansinya untuk mendapatkan OD
600
0,5 ≈ 10
8
CFUml pada spektrofotometer. Blank disc Oxoid direndam di dalam suspensi bakteri endofit, dan diletakkan blank disc
pada sisi kanan kiri biakan R. solani dengan jarak 3,5 cm dari biakan fungi Gambar 3.6.1. Biakan diinkubasi pada suhu ambien. Akitivitas penghambatan
ditentukan berdasarkan zona hambat yang terbentuk di sekitar koloni. Pengamatan dimulai dari hari pertama sampai hari ketujuh. Diagram alir dapat dilihat pada
Lampiran 3. Pengukuran pertumbuhan R. solani dilakukan dengan cara mengukur batas
akhir pertumbuhan dari fungi patogen pada sumbu X dan batas akhir pertumbuhan fungi patogen pada sumbu Y Gambar 3.6.1 , dilakukan setelah terjadi
penghambatan bakteri endofit terhadap fungi patogen dengan rumus uji antagonis: Y
– X 2
Zona hambat mm =
Universitas Sumatera Utara
Gambar 3.6.1 Metode pengukuran zona hambat bakteri terhadap koloni fungi; A. Zona hambat bakteri endofit terhadap hifa koloni fungi;
B. Koloni bakteri C. Titik tengah fungi diletakkan; D. Hifa koloni fungi; E. Media; X. Diameter koloni fungi yang terhambat
pertumbuhannya; Y. Diameter koloni fungi normal
3.7 Pengamatan Hifa Abnormal
Kategori