Tempat dan Waktu Analisis Data

III. BAHAN DAN METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu

Kegiatan penelitian dilaksanakan di lahan melon UPT Pengembangan Agribisnis dan Tanaman Hortikultura Lebo, Sidoarjo; dan Desa Karang Sinom, Indramayu; serta Laboratorium Kesehatan Tanaman Fakultas Pertanian, Universitas Pembangunan Nasional “Veteran” Jawa Timur. Penelitian dilakukan pada Oktober 2013 sampai dengan Februari 2014.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat-alat

Alat penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah Laminar Air Flow LAF, cawan Petri berdiameter 9 cm, autoklaf All American, obyek gelas, tabung reaksi, gelas ukur, bunsen, pipet, jarum ose, scalpel, Erlenmeyer 250 ml, penggaris, pinset, gunting, botol simpan, sprayer botol semprot, mikroskop Will Wetzlar, timbangan analitik Kern PCB, waterbath Memment, growth chamber, cork borer, dan kompor.

3.2.2 Bahan-bahan

Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat bakteri Pseudomonad fluorescens, isolat jamur Fusarium oxysporum f. sp. melonis, benih melon, tanah pasir, aquadest steril, aluminium foil, media King’s B, media Water Agar WA 0,1 , media cair King’s B, media Nutrient Agar NA Merck, media Potato Dextrose Agar PDA Criterion, KOH 3 , H 2 O 2 5 , alkohol 70 , alkohol 95 , tisu, kapas, kertas label, korek api, spirtus, parafilm, lactovenol blue, Methylene blue dan potongan kertas cakram. Hak Cipta © milik UPN Veteran Jatim : Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber.

3.3 Metode Penelitian

3.3.1 Penelitian tahap I : Isolasi dan screening Pseudomonad fluorescens

Metode yang digunakan dalam isolasi dan screening mikroorganisme Pseudomonad fluorescens adalah metode survei dan diskriptif. Dimana hasil isolasi dan screening tersebut akan dilanjutkan dengan pengujian karakteristik Pseudomonad fluorescens berdasarkan sifat gram, fluoresensi, dan pembusukan kentang potato soft root. Uji antagonistik bakteri Pseudomonad fluorescens terhadap jamur patogen Fusarium oxysporum f. sp. melonis secara in vitro Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap RAL. Pengujian tersebut terdiri dari 3 perlakuan dan 4 ulangan dengan penempatan sebagaimana tampak pada denah percobaan yang tertera pada Gambar 1 dengan perlakuan yang dimaksud adalah : PfN2 adalah isolat Pseudomonad fluorescens 1 PfN5 adalah isolat Pseudomonad fluorescens 2 PfN7 adalah isolat Pseudomonad fluorescens 3 Gambar 1. Denah percobaan pada uji antagonistik. 1, 2, 3, 4 adalah ulangan PfN2 3 PfN5 2 PfN2 1 PfN7 2 PfN5 3 PfN5 1 PfN2 4 PfN7 4 PfN5 4 PfN7 1 PfN7 3 PfN2 2 Hak Cipta © milik UPN Veteran Jatim : Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber. Isolasi patogen Fusarium oxysporum f. sp. melonis Metode yang digunakan dalam isolasi Fusarium oxysporum f. sp. melonis adalah metode survei dan diskriptif. Dimana hasil yang diperoleh dibandingkan dengan menggunakan buku taxonomi jamur Illustrated genera of imperfect fungi Barnett dan Hunter, 1972.

3.3.2 Penelitian tahap II : Pola kolonisasi agensia hayati dan patogen

Metode yang digunakan dalam pola kolonisasi agensia hayati dan patogen di rizosfer perkecambahan melon adalah metode diskriptif dan destruktif, dimana pengamatan dilakukan secara mikroskopis dengan perlakuan : Pa adalah aplikasi suspensi bakteri Pseudomonad fluorescens sebanyak 10 ml Pb adalah aplikasi campuran suspensi bakteri Pseudomonad fluorescens sebanyak 5 ml dan Fusarium oxysporum f. sp. melonis sebanyak 5 ml Pc adalah aplikasi suspensi Fusarium oxysporum f. sp. melonis sebanyak 10 ml Uji antibiosis bakteri Pseudomonad fluorescens dari rizosfer perkecambahan melon terhadap Fusarium oxysporum f. sp. melonis secara in vitro Rancangan penelitian yang digunakan dalam uji antibiosis bakteri Pseudomonad fluorescens dari rizosfer perkecambahan melon terhadap jamur patogen Fusarium oxysporum f. sp. melonis adalah Rancangan Acak Lengkap RAL. Pengujian tersebut terdiri dari 4 perlakuan dan 4 ulangan dengan penempatan sebagaimana tampak pada denah percobaan yang tertera pada Gambar 2 dengan perlakuan yang dimaksud adalah : 2 HSI adalah waktu suspensi agensia hayati 2 hari setelah inokulasi 4 HSI adalah waktu suspensi agensia hayati 4 hari setelah inokulasi Hak Cipta © milik UPN Veteran Jatim : Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber. 6 HSI adalah waktu suspensi agensia hayati 6 hari setelah inokulasi 8 HSI adalah waktu suspensi agensia hayati 8 hari setelah inokulasi Gambar 2. Denah percobaan pada uji antibiosis. 1, 2, 3, 4, adalah ulangan

3.4 Pelaksanaan

3.4.1 Penelitian tahap I : Isolasi dan screening bakteri Pseudomonad fluorescens

Mengambil tanah disekitar perakaran rizosfer tanaman melon yang sehat diantara yang sakit beserta akarnya. Sampel tanah yang sudah diambil, kemudian dimasukkan kedalam kantong plastik untuk dibawa ke laboratorium. Isolasi sampel tanah dilakukan di laboratorium dengan cara menimbang sampel tanah sebanyak 25 g, kemudian dimasukkan kedalam erlenmeyer yang berisi 250 ml aquadest steril. Mengkocok erlenmeyer tersebut selama ± 15 menit dengan menggunakan shaker, selanjutnya didiamkan selama 5 menit dan dilakukan seri pengenceran sampai 10 -9 , dengan cara mengambil 1 ml suspensi awal dengan menggunakan mikropipet, kemudian mencampurkan dengan 9 ml air steril kedalam tabung reaksi dan melakukan pengkocokan kembali. Seri pengenceran dilakukan 2 HSI 4 8 HSI 2 6 HSI 2 8 HSI 4 2 HSI 1 2 HSI 3 4 HSI 3 8 HSI 1 8 HSI 3 6 HSI 1 6 HSI 4 2 HSI 2 4 HSI 2 4 HSI 1 4 HSI 4 6 HSI 3 Hak Cipta © milik UPN Veteran Jatim : Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber. dengan cara yang sama sampai dengan 10 -9 , kemudian menumbuhkan suspensi tersebut pada media NA dan inkubasi bakteri selama 24 jam. Mengambil koloni tunggal yang memperlihatkan karakter koloni yang transparan sampai buram, bercahaya, berlendir mucoid dengan bentuk cembung yang jelas Schaad, 2001. Menumbuhkannya pada cawan petri yang berisi media NA dengan cara digores, selanjutnya menginkubasi bakteri lagi selama 24 jam pada suhu ruangan. Setelah mendapatkan isolat yang memperlihatkan karakter koloni bakteri, maka dilanjutkan dengan pengujian karakteristik Pseudomonad fluorescens berdasarkan sifat gram, fluoresensi, dan pembusukan kentang potato soft root yaitu sebagai berikut : a. Uji Gram Membuat larutan KOH 3 dengan cara melarutkan 0,3 g KOH kedalam 100 ml aquadest steril. Mengambil larutan KOH sebanyak 1 tetes kedalam gelas benda, setelah itu mengambil koloni tunggal dari media NA yang telah ditumbuhkan, kemudian menarik secara perlahan koloni tersebut yang telah dicelupkan pada larutan KOH 3 . Pengamatan dilakukan terhadap adanya perubahan masa bakteri tersebut, yaitu perubahan masa bakteri menjadi berlendir dan tertarik ketika diangkat, perubahan masa tersebut menunjukkan bahwa bakteri tersebut bersifat gram negatif Fahy and Hayward, 1983. b. Uji Fluoresensi Mengambil koloni tunggal pada media NA dan menumbuhkannya pada cawan petri yang berisi media King’s B. Menginkubasi bakteri selama 24 jam pada suhu ruangan, setelah itu mengamati bakteri di bawah sinar UV, jika koloni bakteri Hak Cipta © milik UPN Veteran Jatim : Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber. tersebut berpendar dan berwarna hijau maka menghasilkan pigmen fluorescens Brown, 1980. c. Uji Potato Soft Root Memotong buah kentang berbentuk kotak, kemudian mencelupkan kentang tersebut ke dalam alkohol 70 , lalu mencelupkan kembali ke dalam aquadest. Mengambil koloni tunggal bakteri pada media NA dan menggoreskannya pada bagian tengah kentang, setelah itu menaruh ke dalam cawan petri dan menginkubasi selama 24 jam. Pengamatan dilakukan terhadap adanya perubahan fisik kentang yang telah diinokulasi bakteri, berupa membusuk atau tidak membusuk Schaad, 2001. Isolasi jamur Fusarium sp. Mengambil tanaman melon yang menunjukkan gejala layu pada daun bagian bawah yang menguning kecoklatan Semangun, 2000; dan pada batang apabila dibelah, jaringan vaskular menunjukkan perubahan warna coklat Varela dan Seif, 2004 beserta akarnya secara perlahan pada lahan melon di Desa Karang Sinom, Indramayu. Sampel tanaman yang sudah diambil, kemudian dimasukkan kedalam kantong plastik. Melakukan isolasi sampel di laboratorium dengan cara membersihkan bagian batang tanaman yang sakit menggunakan alkohol 70 . Mengering anginkan, kemudian memotong antara bagian kulit batang tanaman yang menunjukkan gejala nekrosis dan yang sehat menggunakan scalpel. Menginokulasi potongan tersebut pada media PDA. selanjutnya menginkubasi selama ± 5 hari Sastrahidayat, 1994. Memurnikan jamur patogen yang memiliki ciri morfologi koloni seperti jamur Fusarium oxysporum f. sp. melonis yaitu miselium berwarna putih hingga merah Hak Cipta © milik UPN Veteran Jatim : Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber. muda dan membentuk percabangan di dalam media Semangun, 2004. Selanjutnya memperbanyak jamur Fusarium sp. pada media PDA. Identifikasi jamur Fusarium oxysporum f. sp. melonis Jamur Fusarium sp. yang sudah murni kemudian diidentifikasi berdasarkan morfologi koloni dan pengamatan mikroskopis. Identifikasi dilakukan terhadap warna, hifa, dan spora jamur tersebut. Hasil pengamatan morfologi jamur yang diperoleh dibandingkan dengan morfologi jamur Fusarium oxysporum f. sp. melonis menggunakan buku taxonomi jamur Illustrated genera of imperfect fungi Barnett dan Hunter, 1972. Uji antagonistik bakteri Pseudomonad fluorescens terhadap jamur patogen Fusarium oxysporum f. sp. melonis secara in vitro Pengujian antagonistik bakteri Pseudomonad fluorescens yang telah diisolasi dari rizosfer melon dilakukan terhadap Fusarium oxysporum f. sp. melonis di laboratorium. Uji antagonistik dilakukan dengan cara mensterilkan potongan kertas cakram berdiameter 0.5 cm ke dalam autoklaf. Mencelupkan potongan kertas cakram kedalam suspensi bakteri Pseudomonad fluorescens selama ± 10 menit, kemudian meletakkan kertas cakram tersebut pada cawan petri yang berisi media PDA. Pengambilan jamur Fusarium oxysporum f. sp. melonis dengan menggunakan cork borer berdiameter 0.5 cm, dan meletakkan pada cawan petri yang sama dengan posisi kedua isolat berhadapan dengan jarak 3 cm di tengah cawan petri Fokkema, 1976. Menginkubasi selama 24 jam, selanjutnya melakukan pengamatan terhadap adanya zona bening diantara kedua mikroorganisme tersebut, dimana isolat yang Hak Cipta © milik UPN Veteran Jatim : Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber. mempunyai persentase daya hambat tertinggi akan digunakan dalam penelitian tahap berikutnya. 3.4.2 Penelitian tahap II : Inokulasi Pseudomonad fluorescens dan Fusarium oxysporum f. sp. melonis pada tanah pasir Mensterilkan tanah pasir sebagai media tumbuh menggunakan autoklaf pada suhu 121 ºC dengan tekanan 15 pcs per square inci selama ± 20 menit, untuk bakteri Pseudomonad fluorescens umur 2 hari dilakukan seri pengenceran sampai 10 -7 , sedangkan untuk jamur Fusarium oxysporum f. sp. melonis umur 7 hari dilakukan seri pengenceran sampai 10 -6 , setelah itu melakukan inokulasi yang masing-masing menggunakan 10 ml per lubang tray Olivain, Humber, Nahalkova, Fatehi, Horidon, dan Alobouvete, 2006. Aplikasi Benih Melon pada Tanah Pasir Mensterilkan benih melon dengan cara merendam benih ke dalam alkohol 95 selama 10 detik, kemudian merendam benih kedalam H 2 O 2 5 dengan mengkocok selama ± 5 menit, selanjutnya membilas benih menggunakan aquadest steril sebanyak 7 kali. Mensterilkan kertas cakram berdiameter 9 cm menggunakan autoklaf, kemudian membasahi kertas cakram menggunakan aquadest steril, selanjutnya menginokulasi benih pada kertas cakram. Menginkubasi benih selama 4 hari dalam keadaan gelap pada suhu ± 22 ºC. Benih yang telah berkecambah dengan ukuran 1 cm, ditanam pada tanah pasir yang telah diinokulasikan sesuai dengan perlakuan yang diteliti dan selanjutnya dilakukan pengamatan. Hak Cipta © milik UPN Veteran Jatim : Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber. Pengamatan pola kolonisasi pada akar perkecambahan melon Pengamatan dilakukan pada hari ke-1, ke-3, dan ke-5 setelah inokulasi dengan mencuci kecambah akar dari tanah yang menempel, selanjutnya melakukan perendaman dengan KOH selama 60 menit. Mencuci kecambah akar menggunakan aquadest steril, untuk memudahkan pemotretan terhadap pola koloni Fusarium oxysporum f. sp. melonis dengan menggunakan metode scanning dengan lactovenol blue . Bagian akar yang telah diperlakukan tersebut diletakkan pada gelas benda cekung berisi media 0,1 WA. Melakukan pengamatan pola koloni Pseudomonad fluorescens dengan mencuci kecambah akar menggunakan aquadest steril, melakukan perendaman dengan KOH selama 60 menit, kemudian kembali mencuci kecambah akar menggunakan aquadest steril, untuk memudahkan pemotretan terhadap pola koloni Pseudomonad fluorescens dengan menggunakan metode scanning dengan methylene blue , selanjutnya meletakkan bagian akar pada gelas benda cekung berisi media cair King’s B. Pengamatan pola koloni Fusarium oxysporum f. sp. melonis dan Pseudomonad fluorescens dilakukan dengan mencuci kecambah akar dari tanah yang menempel, selanjutnya melakukan perendaman dengan KOH selama 60 menit. Mencuci kecambah akar menggunakan aquadest steril, selanjutnya akar kecambah dicelupkan kedalam lactovenol blue.selama 30 detik dan mencuci akar kecambah dengan aquadest steril, akar kecambah yang telah dicuci dicelupkan kedalam methylene blue selama 30 detik dan dicuci kembali dengan aquadest steril, selanjutnya meletakkan bagian akar pada gelas benda cekung dan mengamati masing-masing pola koloni sesuai dengan perlakuan menggunakan mikroskop. Hak Cipta © milik UPN Veteran Jatim : Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber. Uji antibiosis bakteri Pseudomonad fluorescens dari rizosfer perkecambahan melon terhadap Fusarium oxysporum f. sp. melonis secara in vitro Melakukan uji antibiosis dengan cara menimbang 1 g tanah yang mengandung suspensi Pseudomonad fluorescens, kemudian dimasukkan ke dalam 10 ml aquadest steril, selanjutnya mengkocok selama 5 menit dan diendapkan selama ± 3 jam. Mensentrifus suspensi tanah tersebut dengan kecepatan ± 200 rpm selama ± 20 menit, selanjutnya mengambil supenatan yang telah mengandung bahan antibiosis dan menyimpan dalam lemari es selama 24 jam. Mengambil jamur Fusarium oxysporum f. sp. melonis dengan menggunakan cork borer berdiameter 0.5 cm, kemudian meletakkan pada cawan petri yang berisi media PDA. Mensterilkan potongan kertas cakram berdiameter 0.5 cm, kemudian dicelupkan ke dalam larutan antibiosis Pseudomonad fluorescens selama 10 menit dan dikering anginkan, setelah itu meletakkan potongan kertas cakram pada cawan petri yang sama, dengan posisi kedua isolat berhadapan dengan jarak 3 cm di tengah cawan petri, selanjutnya melakukan inkubasi selama 24 jam.

3.5 Pengamatan

Pengamatan pada penelitian ini dilakukan secara destruktif dan parameter yang diamati pada penelitian ini adalah sebagai berikut :

3.5.1 Persentase daya hambat

Pengamatan dilakukan terhadap jari-jari koloni jamur Fusarium oxysporum, persentase daya hambat bakteri Pseudomonad flourescens terhadap patogen Fusarium oxysporum dihitung dengan rumus Fokkema, 1976 sebagai berikut : Hak Cipta © milik UPN Veteran Jatim : Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber. I = R1-R2 R1 ×100 Keterangan : I adalah Persentase daya hambat . R1 adalah jari-jari koloni Fusarium oxysporum yang tumbuh berlawanan dengan Pseudomonad fluorescens . R2 adalah jari-jari koloni Fusarium oxysporum yang arahnya tumbuh menuju pusat Pseudomonad fluorescens. Gambar 3. Cara pengukuran koloni Fusarium oxysporum untuk menghitung persentase daya hambat antibiosis oleh mikroorganisme antagonis Pseudomonad fluorescens . A adalah inokulum antagonis Pseudomonad fluorescens B adalah inokulum Fusarium oxysporum R1 adalah jari-jari koloni Fusarium oxysporum yang tumbuh berlawanan dengan Pseudomonad fluorescens R2 adalah jari-jari koloni Fusarium oxysporum yang arahnya tumbuh menuju pusat Pseudomonad fluorescens

3.5.2 Pola kolonisasi akar

Kolonisasi akar adalah suatu proses di mana bakteri diinokulasikan ke dalam benih atau tanah, dapat bertahan hidup dan menggandakan diri, berasosiasi dengan R1 B 3 CM R2 A Hak Cipta © milik UPN Veteran Jatim : Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber. permukaan akar dan mengkoloni sistem akar yang sedang berkembang dalam tanah Baker dan Cook, 2002. Pengamatan dilakukan pada hari ke-1, ke-3, dan ke-5 setelah transplanting, pengamatan pada pola kolonisasi akar Pseudomonad fluorescens menggunakan methylene blue dan media cair King’s B sedangkan pada pola kolonisasi akar Fusarium oxysporum f. sp. melonis pengamatan dilakukan menggunakan lactovenol blue dan media 0,1 WA, masing-masing pengamatan dilakukan secara mikroskopis.

3.6 Analisis Data

Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dianalisis dengan uji varian tunggal one way anova F pada taraf 5 , apabila pada hasil analisis menunjukkan bahwa F hitung F tabel maka dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil BNT pada taraf 5 . Hak Cipta © milik UPN Veteran Jatim : Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi dan Screening Bakteri Pseudomonad fluorescens

Hasil isolasi bakteri dari sampel tanah rizosfer melon diperoleh sembilan koloni bakteri, yaitu Psudomonad fluorescens PfN1, PfN2, PfN3, PfN4, PfN5, PfN6, PfN7, PfN8, dan PfN9 Tabel 1.. Tabel 1. Karakteristik Koloni Bakteri Isolat Morfologi Koloni Uji Bentuk Diameter Konsistensi Warna Gram Fluoresensi potato soft root PfN1 Bundar 5 mm Berlendir Putih susu Gram - Negatif - PfN2 Bundar 3 mm Berlendir Putih susu Gram - Positif Negatif PfN3 Bundar 5 mm Berlendir Putih Gram - Positif Positif PfN4 Bundar 5 mm Berlendir Putih Gram + - - PfN5 Bundar 5 mm Berlendir Putih susu Gram - Positif Negatif PfN6 Bundar 4 mm Berlendir putih Gram - Positif Positif PfN7 Bundar 1 mm Berlendir Putih kekuningan Gram - Positif Negatif PfN8 Bundar 5 mm Berlendir Putih Gram - Negatif - PfN9 Bundar 7 mm Berlendir Pastel Gram + - - Keterangan : adalah bakteri Pseudomonad fluorescens adalah tanda bahwa isolat tidak dilakukan uji lanjutan Sembilan isolat dilakukan pengujian karakteristik Pseudomonad fluorescens berdasarkan sifat gram, fluoresensi, dan pembusukan kentang potato soft root. Hasil kesembilan isolat menunjukkan bahwa isolat PfN2, PfN5, dan PfN7 merupakan bakteri Pseudomonad fluorescens Tabel 1., ketiga isolat bersifat gram negatif ditunjukkan dengan adanya campuran kental seperti lendir dan bila ditarik keatas menggunakan jarum ose larutan akan tertarik dan lengket. Ratdiana 2007 Hak Cipta © milik UPN Veteran Jatim : Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber.