Defenisi Operasional Persiapan Suspensi Bakteri

22

3.4 Defenisi Operasional

 S. mutans adalah bakteri yang berasal dari stem cell yang merupakan perkembangan S. mutans diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara.  Sirih hijau adalah sirih hijau yang tumbuh di Desa Purwojoyo Kabupaten Deli Serdang, Sumatera Utara.  Ekstrak daun sirih hijau pelarut etanol adalah ekstrak yang diperoleh dengan melakukan ekstraksi daun sirih hijau yang telah dimaserasi dengan pelarut etanol 96 sehingga diperoleh ekstrak kental.  Diameter zona hambat adalah diameter zona dimana bakteri tidak tumbuh ditandai dengan zona bening yang diukur dengan kaliper dengan satuan milimeter.  Konsentrasi efektif adalah konsentrasi yang memiliki daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri dengan diameter daya hambat berukuran 12-24 mm mengacu pada standar umum obat asal tanaman Departemen Kesehatan,1988. 8  Ekstrak daun sirih hijau konsentrasi 20 adalah 2 gr ekstrak daun sirih hijau dalam 10 ml etanol 96 200 mgml.  Kadar hambat minimum adalah kadar hambat minimal yang masih memiliki pengaruh terhadap pertumbuhan S. mutans, dimana konsentrasi dibawah kadar hambat minimum tidak lagi menunjukkan daya hambat terhadap pertumbuhan S. mutans. Universitas Sumatera Utara 23

3.5 Bahan dan Alat Penelitian

3. 5.1 Alat Penelitian

 Cakram kosong Oxoid  Autoklaf Yamamoto SN 210  Oven Gallenkomp  Inkubator Fisher scientific Isotemp Incubator model 630-D  Kaliper Krisbow  Erlenmeyer 250ml pyrex  Gelas ukur 100ml pyrex  Vaccum Rotary Evaporator  Neraca Analitic Electric  Tabung reaksi Pyrex  Blender  Freeze Dryer  Vortex  Pisau  Aluminium foil 1 gulungan  Kertas saring  Rak tabung reaksi  Sprayer  Cotton bud steril  Hot Plate Universitas Sumatera Utara 24  Cawan petri  Pipet micro dan tissue  Batang pengaduk  Bunsen  Ose Gambar 3. Cakram Kosong Oxoid Gambar 4. Autoklaf Yamamoto SN 210 Gambar 5. Vaccum rotary evaporator Universitas Sumatera Utara 25

3.5.2 Bahan Penelitian

 Daun sirih hijau sebanyak 3,5 kg.  Pelarut etanol 96 7,5 liter  Biakan murni S.mutans  Media MHA Mueller Hinton Agar  Media Nutrient agar  Spritus  Alkohol 70  Wipol  Kapas Steril  Cotton Bud steril  Spritus  Aquades  NaCl 0,85  NaOCl 0,5

3.6 Tempat dan Waktu Penelitian

3.6.1 Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi Fakultas Farmasi USU, Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi USU, Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU. Universitas Sumatera Utara 26

3.6.2 Waktu Penelitian

Waktu penelitian:  Penulisan skripsi selama 11 bulan yaitu Agustus 2010- Juli 2011  Penelitian Laboratorium selama 3 bulan yaitu April-Juni 2011

3.7 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data

Tahap- tahap pengambilan dan pengumpulan data pada penelitian ini adalah sebagai berikut:

3.7.1 Pembuatan Media Bakteri

Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media Nutrient agar yang digunakan untuk pembiakan bakteri, sebanyak 2 gram Nutrient agar dilarutkan ke dalam 100 ml akuades, lalu dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian dibuat media Mueller Hinton Agar MHA yang digunakan untuk uji aktifitas antibakteri dari bahan coba. Sebanyak 15,2 gram Mueller Hinton Agar dilarutkan ke dalam 400 ml akuades, lalu dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Setelah media masak, disterilkan ke dalam autoklaf selama 2 jam dengan tekanan udara 2 atm atau suhu 121 C. Setelah disterilkan, media disimpan di dalam kulkas. Jika akan digunakan, media dipanaskan kembali hingga mendidih lalu dituangkan ke dalam cawan petri. Universitas Sumatera Utara 27 Gambar 6. Penuangan media dalam cawan petri

3.7.2 Pembiakan Spesimen Biakan uji bakteri yang digunakan pada penelitian

S. mutans berasal dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara. Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana aerob. Dilakukan pembiakan S.mutans pada cawan petri berisi media padat Nutrient agar NA yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya. Biakan bakteri diinkubasi dalam suasana aerob pada suhu 37 C selama 24 jam, lalu diamati apakah bakteri S. mutans murni telah tumbuh subur. Apabila pertumbuhan bakteri tidak subur dan terjadi kontaminasi bakteri lain, prosedur pembiakkan bakteri dan pengamatan diulang kembali.

3.7.3 Pembuatan Ekstrak Daun Sirih Hijau

Pembuatan ekstrak daun sirih hijau dilakukan melalui tiga tahapan, pertama dengan metode perkolasi yaitu penyaringan ekstrak daun sirih dalam rendaman etanol 96, tahap kedua yaitu rotari evaporator dengan tujuan untuk menguapkan Universitas Sumatera Utara 28 etanol 96 yang telah mengikat ekstrak daun sirih sehingga akan diperoleh ekstrak yang kental, tahapan yang terakhir yaitu freeze dryer, tujuannya untuk mengeringkan ekstrak yang masih mengandung etanol 96. Sebanyak 3,5 kg daun sirih hijau segar dicuci hingga bersih, dipotong kecil- kecil dan kemudian dikeringkan selama 10 hari. Setelah dikeringkan maka diperoleh daun sirih yang kering dengan kadar air 10 dan disebut dengan simplisia. Simplisia dihaluskan dengan blender dan diperoleh serbuk daun sirih sebanyak ±300gr. Serbuk ini kemudian dicampur dengan pelarut etanol 96 di dalam suatu wadah sambil diaduk-aduk. Serbuk akan menyerap etanol sehingga serbuk akan terlihat mengembang, untuk itu perlu dilakukan penambahan etanol hingga serbuk tidak menyerap etanol lagi. Setelah itu didiamkan selama 3 jam. Proses selanjutnya disebut dengan perkolasi yaitu menyaring campuran serbuk dan etanol dalam suatu botol terbalik. Di dalam botol terdapat beberapa lapisan bahan. Mulai dari bagian bawah, diletakkan sebuah karet penutup botol sebagai penahan infusa yang terhubung dengan botol penampung ekstrak, kemudian dilapisan selanjutnya diletakkan kapas dan kertas saring sebagai penyaring ekstrak agar diperoleh ekstrak yang jernih. Kemudian campuran serbuk daun sirih dan etanol berada di atasnya dan dilapisi lagi oleh kertas saring. Larutan etanol yang digunakan sepanjang 5 cm jika diukur dengan menggunakan penggaris. Botol ditutup dengan menggunakan aluminium foil dan plastik. Kemudian terus ditambahkan pelarut etanol 96 sampai diperoleh ekstrak daun sirih yang jernih dan dipantau untuk melihat larutan etanol tidak kering. Setelah diperoleh ekstrak yang jernih, dilakukan rotavasasi dan freeze dryer untuk memperoleh ekstrak yang kental. Universitas Sumatera Utara 29

3.7.4 Uji Efektifitas Anti Bakteri

Biakan uji bakteri yang digunakan pada penelitian adalah S.mutans pada media Nutrient agar yang diambil dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara. Urutan pengujian antibakteri S.mutans adalah sebagai berikut :

a. Persiapan Suspensi Bakteri

Alat-alat yang akan digunakan pada proses uji aktivitas antibakteri terlebih dahulu dicuci bersih kemudian dikeringkan dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Kemudian sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh subur, disuspensikan dengan menggunakan NaCl 0,85 sampai diperoleh kekeruhan yang sama dengan standard Mc.Farland 1x10 8 CFUml. Setelah itu sebanyak 400 ml MHA dibagi ke dalam 28 petri yang telah disediakan, dibiarkan sampai memadat, kemudian tiap cawan petri dibagi menjadi 4 area. Suspensi bakteri diambil dengan menggunakan cotton bud steril lalu diswab ke seluruh permukaan media secara merata dan dieramkan dalam inkubator selama 15 menit.

b. Peletakan Cakram yang Telah Ditetesi Bahan Coba pada Media