Alat-alat Bahan-bahan Bagan Penelitian Hasil Penelitian

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat-alat

1. Gelas ukur 100 mL 10 mL Pyrex 2. Gelas beaker 250 mL 1000 mL Pyrex 3. Gelas erlenmeyer 500 mL 100 mL Pyrex 4. Corong kaca 5. Corong pisah 500 mL Pyrex 6. Ekstraktor 5000 mL Schoot Duran 7. Tabung reaksi Pyrex 8. Batang pengaduk 9. Pipet tetes 10. Pipa kapiler 11. Spatula 12. Rotarievaporator Bűchi R-114 13. Labu rotarievaporator 1000 mL 14. Labu didih 1000 mL Schoot Duran 15. Labu takar 250 mL Pyrex 16. Kolom kromatografi Pyrex 17. Botol vial 18. Neraca analitis Mettler AE 200 19. Lampu UV 254 nm 356 nm UVGL 58 20. Statif dan klem 21. Penangas air 22. Alat destilasi 23. Bunsen 24. Bejana Kromatografi Lapis Tipis 25. Bejana Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 26. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu Universitas Sumatera Utara 27. Spektrofotometer UV-Visible 28. Spektrometer 1 H-NMR JeolDelta2NMR500MHz

3.2 Bahan-bahan

1. Daun tumbuhan jambu air Syzygium aqueaBurm.f.Alston 2. Metanol Destilasai 3. N-heksana Teknis 4. Etil asetat Teknis 5. Aquadest 6. Kloroforom Teknis 7. Benzena p. a. E. Merck 8. Aseton p.a.E.Merck 9. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KGaA 10. FeCl 3 11. NaOH 10 5 12. Mg-HCl 13. H 2 SO 14. HCl 2N 4P 15. Plat KLT Merck Kieselgel 60 F 16. Plat KLT Preparatif Merck Kieselgel 60 F 254 17. Pereaksi Benedict 254 18. Kertas saring Whatmann no.42

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan jambu air Syzygium aquea Burm.f. Alston yang diperoleh dari daerah Padang Bulan , Jln. Abdul Hakim Gang Susuk III, Sumatera Utara. Daun tumbuhan jambu air dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun jambu air sebanyak 1230 g. Universitas Sumatera Utara

3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Jambu Air

Serbuk daun tumbuhan jambu air diidentifikasikan dengan menggunakan cara: 1. Skrining Fitokimia 2. Analisis Kromatografi Lapis Tipis

3.3.2.1 Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun tumbuhan jambu air maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut: A. Untuk pelarut metanol - Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun tumbuhan jambu air Syzygium aquea Burm.f. Alston yang telah dikeringkan dan dipotong kecil-kecil ke dalam erlenmeyer - Ditambahkan metanol ± 100 mL - Didiamkan - Disaring - Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi: a. Tabung I : dengan FeCl 3 b. Tabung II : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda 5 menghasilkan larutan berwarna hitam c. Tabung III : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru violet d. Tabung IV : dengan H 2 SO 4p menghasilkan larutan orange kekuningan B. Untuk pelarut Etil Asetat - Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun tumbuhan jambu air Syzygium aquea Burm.f. Alston yang telah dikeringkan dan dipotong kecil-kecil ke dalam erlenmeyer - Ditambahkan etil asetat ± 100 mL - Didiamkan - Disaring - Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi: Universitas Sumatera Utara a. Tabung I : dengan FeCl 3 b. Tabung II : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda 5 menghasilkan larutan berwarna hitam c. Tabung III : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru violet d. Tabung IV : dengan H 2 SO 4p menghasilkan larutan orange kekuningan

3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah campuran n-heksana : etil asetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10 v v ⁄ , 80:20 v v ⁄ , 70:30 v v ⁄ , 60:40 dan 50:50 v v ⁄ . Dimasukkan 10 mL larutan fase gerak n-heksana : etil asetat 90:10 v v ⁄ kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl 3 5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksan : etil asetat dengan perbandingan 80:20 v v ⁄ , 70:30 v v ⁄ , 60:40 v v ⁄ . dan 50:50 v v ⁄ .

3.3.3 Memperoleh Ekstrak Pekat Metanol dari Daun Tumbuhan Jambu Air

Syzygium aquea Burm.f. Alston Serbuk daun tumbuhan jambu air ditimbang sebanyak 1230 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 7 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama Universitas Sumatera Utara ± 24 jam. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tanin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol. Fraksi metanol dihidrolisa dengan menggunakan HCl 6. Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan kloroform secara berulang-ulang. Ekstrak kloroform dipekatkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 1,85 g.

3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10 v v ⁄ , 80:20 v v ⁄ , 70:30 v v ⁄ , 60:40 v v ⁄ dan 50:50 v v ⁄ . Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksan 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 1,85 g ekstrak metanol daun tumbuhan jambu air ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksan : etil asetat 90:10 v v ⁄ secara perlahan – lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksan : etil asetat dengan perbandingan 80:20vv , 70:30vv, 60:40vv dan 50:50 vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 12 ml , lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl 3 5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk kristal. Universitas Sumatera Utara

3.3.5 Pemutusan Gula dari Senyawa Flavonoida

Pemutusan gula dari senyawa flavonoida dilakukan dengan cara hidrolisis asam menggunakan HCl 2 N sambil dipanaskan kemudian dipartisi dengan kloroform. Senyawa yang diperoleh dari kolom kromatografi dilarutkan dengan metanol kemudian dihidrolisa dengan menggunakan HCl 2N lalu dipanaskan selama ± 1 jam dan disaring. Filtrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan kloroform secara berulang-ulang. Lapisan kloroform diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 1,03 g.

3.3.6 Pemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Pemurnian senyawa flvonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif dilakukan karena hasil analis KLT dari kristal yang diperoleh dengan kromatografi kolom menunjukkan hasil yang belum murni. Ekstrak pekat kloroform dilarutkan kembali dengan kloroform lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai untuk Kromatomatografi Lapis Tipis Preparatif. N-heksan : Etil asetat 80:20 v v ⁄ adalah fasa gerak yang menunjukkan pemisahan paling baik untuk selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana KLT preparatif. Selanjutnya kristal yang telah dilarutkan tadi ditotolkan secara perlahan- lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Plat dimasukkan kedalam bejana berisi pelarut yang telah dijenuhkan kemudian ditutup. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan digerus dari plat lalu dielusi dengan methanol : etil asetat 1:1. Hasil elusi diuapkan hingga terbentuk kristal. Universitas Sumatera Utara

3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi

3.3.7.1 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis

Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak n-heksana : eti asetat 80:20 vv. Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi lapis tipis, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan kloroform pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi lapis tipis yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas atas, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl 3 5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid.

3.3.7.2 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Penentuan Titik Lebur

Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan kedalam melting point apparatus lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur.

3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible

Analisis dengan alat spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut. Universitas Sumatera Utara

3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR

Analisis dengan alat spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut.

3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton

1 H- NMR Analisa dengan alat spektrometer 1 H-NMR diperoleh dari Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan CDCl 3 sebagai pelarut. 32 Universitas Sumatera Utara Serbuk daun tumbuhan jambu air Syzygium aquea Burm.f. Alston Diekstraksi maserasi dengan metanol Disaring Dipekatkan Dibagi kedalam 4 tabung reaksi Tabung I Tabung II Tabung III Tabung IV Ditambahkan pereaksi FeCl 3 5 Diamati perubahan warna Larutan hitam Ditambahkan pereaksi NaOH 10 Diamati perubahan warna Larutan biru violet Ditambahkan pereaksi H 2 SO 4p Diamati perubahan warna Larutan merah muda Ditambahkan pereaksi Mg-HCl Diamati perubahan warna Larutan orange kekuningan

3.4 Bagan Skrining Fitokimia

3.4.1 Ekstraksi maserasi dengan Metanol

Universitas Sumatera Utara Serbuk daun tumbuhan jambu air Syzygium aquea Burm.f. Alston Diekstraksi maserasi dengan etil asetat Disaring Dipekatkan Dibagi kedalam 4 tabung reaksi Tabung I Tabung II Tabung III Tabung IV Ditambahkan pereaksi FeCl 3 5 Diamati perubahan warna Larutan hitam Ditambahkan pereaksi NaOH 10 Diamati perubahan warna Larutan biru violet Ditambahkan pereaksi H 2 SO 4p Diamati perubahan warna Larutan merah muda Ditambahkan pereaksi Mg-HCl Diamati perubahan warna Larutan orange kekuningan

3.4.2 Ekstraksi maserasi dengan Etil asetat

34 Universitas Sumatera Utara 1230 gram serbuk daun tumbuhan jambu air Syzygium aqueaBurm.f.Alston diskrining fitokimia dimaserasi dengan metanol sebanyak 7 L didiamkan selama ± 24 jam dilakukan sebanyak 4 kali disaring Ekstrak metanol Residu diskrining fitokimia Ekstrak pekat metanol diuapkan hingga semua metanol menguap dilarutkan dengan etil asetat disaring Ekstrak etil asetat Endapan diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator Ekstrak pekat etil asetat diuapkan hingga semua etil asetat menguap dilarutkan dengan metanol diekstraksi partisi dengan n-heksana berulang ulang sampai bening Lapisan metanol Lapisan n-heksana tidak dilanjutkan diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan hingga pekat dilakukan uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict + dihidrolisis dengan HCl 6 sambil dipanaskan selama 1 jam didinginkan disaring Ekstrak metanol asam Residu diekstraksi partisi dengan kloroform Lapisan kloroform Lapisan metanol asam dipekatkan Ekstrak pekat kloroform diskrining fitokimia diuji Kromatografi Lapis Tipis dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak eluen n-heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50 v v ditampung tiap fraksi sebanyak ± 12 mL dalam botol vial digabung fraksi dengan Rf yang sama diuji Kromatografi Lapis Tipis dipekatkan dengan rotarievaporator diskrinig fitokimia

3.5 Bagan Penelitian

Lanjutan 35 Universitas Sumatera Utara Fraksi 9-23 90:10 Fraksi 24-38 80:20 Fraksi 39-53 70:30 Fraksi 54-97 60:40 diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 Hasil negatif Hasil positif Hasil positif Hasil positif dianalisis Kromatografi Lapis Tipis dipreparatif dengan eluen n-heksan:etil asetat 80:20 vv dikeringkan disinari di bawah lampu UV digerus dari plat dilarutkan dengan campuran metanol : etil asetat 1:1 disaring Senyawa murni dianalisis Kromatografi Lapis Tipis diuapkan dianalisis dengan spektrofotmeter UV-Vis, spektrofotometer Inframerah FT-IR, spektrometer 1 H-NMR Hasil Analisis Fraksi 98-143 50:50 Hasil positif diuji FeCl 5 36 Universitas Sumatera Utara BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

Dari hasil skrining pendahuluan terhadap ekstrak metanol dan etil asetat dari daun tumbuhan jambu air dengan adanya penambahan pereaksi-pereaksi warna untuk menentukan golongan senyawa kimia yang dikandung dengan menggunakan pereaksi flavonoida ternyata sampel positif mengandung flavonoida. Hasil isolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan jambu air berupa kristal berwarna kuning dengan berat 7 mg dan harga Rf 0,35 diperoleh dengan menggunakan fasa gerak n-heksana:etil asetat 80:20 vv. Spektrum UV-Visible senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut metanol ditunjukkan pada gambar 4.1 dibawah ini : Gambar 4.1 Spektrum UV-Visibel Senyawa Hasil Isolasi 1. Pita I memberikan panjang gelombang 310,0 nm 2. Pita II memberikan panjang gelombang 290,0 nm Universitas Sumatera Utara Hasil analisis spektrofotometer FT-IR dari kristal hasil isolasi menghasilkan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang yang dapat dilihat pada Gambar 4.2. O HO OCH 3 CH 3 CH 3 O 3 4 5 6 7 2 8 1 2 3 4 5 6 1 A C B Gambar 4.2 Spektrum Inframerah FT-IR Senyawa Hasil Isolasi Hasil analisis Spektrofotometer FT-IR pada pasta hasil isolasi menghasilkan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang sebagai berikut: 1. Pada bilangan gelombang 3429,43-3390,86 cm 2. Pada bilangan gelombang 3236,55-3192,19 cm -1 3. Pada bilangan gelombang 2956,87-2933,73 cm -1 4. Pada bilangan gelombang 1639,49 cm -1 5. Pada bilangan gelombang 1504,48 cm -1 6. Pada bilangan gelombang 1456,26 cm -1 7. Pada bilangan gelombang 1369,46 cm -1 8. Pada bilangan gelombang 1274,95 cm -1 -1 Universitas Sumatera Utara 9. Pada bilangan gelombang 1165,00 cm 10. Pada bilangan gelombang 1022,27 cm -1 11. Pada bilangan gelombang 916,19 cm -1 -1 Hasil analisis Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton 1 O CH 3 HO O 1 2 4 5 6 2 4 6 7 8 1 A B C 3 CH 3 OCH 3 5 3 H 2 H 6 H 2 H 5 H 6 H 8 OCH 3 H eq H ax CH 3 CH 3 H3eq H3ax H-NMR memberikan pergeseran kimia pada daerah ppm seperti gambar. Gambar 4.3 Spektrum 1 1. δ = 2,1404 ppm menunjukkan puncak singlet H-NMR Senyawa Hasil Isolasi 2. δ = 2,1832 ppm menunjukkan puncak singlet 3. δ = 2,7708 - 28110 ppm menunjukkan puncak doublet doublet 4. δ = 3,1470 - 3,1855 ppm menunjukkan puncak doublet doublet 5. δ = 3,6113 ppm menunjukkan puncak singlet Universitas Sumatera Utara 6. δ = 5,5453 - 5,5648 ppm menunjukkan puncak doublet doublet 7. δ = 5,9578 - 59889 ppm menunjukkan puncak doublet 8. δ = 7,4300, 7,4456 dan 7,4598 ppm menunjukkan puncak triplet 9. δ = 7,5545-7,5688 ppm menunjukkan puncak doublet

3.5 Pembahasan