BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Alat-alat
1. Gelas ukur
100 mL 10 mL Pyrex
2. Gelas beaker
250 mL 1000 mL Pyrex
3. Gelas erlenmeyer
500 mL 100 mL Pyrex
4. Corong kaca
5. Corong pisah
500 mL Pyrex
6. Ekstraktor
5000 mL Schoot Duran
7. Tabung reaksi
Pyrex 8.
Batang pengaduk 9.
Pipet tetes 10.
Pipa kapiler 11.
Spatula 12.
Rotarievaporator Bűchi R-114
13. Labu rotarievaporator
1000 mL 14.
Labu didih 1000 mL
Schoot Duran 15.
Labu takar 250 mL
Pyrex 16.
Kolom kromatografi Pyrex
17. Botol vial
18. Neraca analitis
Mettler AE 200 19.
Lampu UV 254 nm 356 nm
UVGL 58 20.
Statif dan klem 21.
Penangas air 22.
Alat destilasi 23.
Bunsen 24.
Bejana Kromatografi Lapis Tipis 25.
Bejana Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 26.
Spektrofotometer FT-IR Shimadzu
Universitas Sumatera Utara
27. Spektrofotometer UV-Visible
28. Spektrometer
1
H-NMR JeolDelta2NMR500MHz
3.2 Bahan-bahan
1. Daun tumbuhan jambu air Syzygium aqueaBurm.f.Alston
2. Metanol
Destilasai 3.
N-heksana Teknis
4. Etil asetat
Teknis 5.
Aquadest 6.
Kloroforom Teknis
7. Benzena
p. a. E. Merck 8.
Aseton p.a.E.Merck
9. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM
E.Merck. KGaA 10.
FeCl
3
11. NaOH 10
5
12. Mg-HCl
13. H
2
SO 14.
HCl 2N
4P
15. Plat KLT
Merck Kieselgel 60 F 16.
Plat KLT Preparatif Merck Kieselgel 60 F
254
17. Pereaksi Benedict
254
18. Kertas saring
Whatmann no.42
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan jambu air Syzygium aquea Burm.f. Alston yang diperoleh dari daerah Padang Bulan , Jln. Abdul Hakim Gang Susuk III,
Sumatera Utara. Daun tumbuhan jambu air dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun jambu air sebanyak 1230 g.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Jambu Air
Serbuk daun tumbuhan jambu air diidentifikasikan dengan menggunakan cara: 1.
Skrining Fitokimia 2.
Analisis Kromatografi Lapis Tipis
3.3.2.1 Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun tumbuhan jambu air maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut:
A. Untuk pelarut metanol
- Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun tumbuhan jambu air Syzygium aquea
Burm.f. Alston yang telah dikeringkan dan dipotong kecil-kecil ke dalam erlenmeyer
- Ditambahkan metanol ± 100 mL
- Didiamkan
- Disaring
- Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi
- Ditambahkan masing-masing pereaksi:
a. Tabung I : dengan FeCl
3
b. Tabung II : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda
5 menghasilkan larutan berwarna hitam
c. Tabung III : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru violet
d. Tabung IV : dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan orange kekuningan
B. Untuk pelarut Etil Asetat
- Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun tumbuhan jambu air Syzygium aquea
Burm.f. Alston yang telah dikeringkan dan dipotong kecil-kecil ke dalam erlenmeyer
- Ditambahkan etil asetat ± 100 mL
- Didiamkan
- Disaring
- Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi
- Ditambahkan masing-masing pereaksi:
Universitas Sumatera Utara
a. Tabung I
: dengan FeCl
3
b. Tabung II
: dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda
5 menghasilkan larutan berwarna hitam
c. Tabung III
: dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru violet d.
Tabung IV : dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan orange kekuningan
3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang
digunakan adalah campuran n-heksana : etil asetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10
v v
⁄ , 80:20 v v ⁄ ,
70:30 v
v ⁄ , 60:40 dan 50:50 v v
⁄ .
Dimasukkan 10 mL larutan fase gerak n-heksana : etil asetat 90:10 v
v ⁄
kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang
telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl
3
5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksan : etil asetat
dengan perbandingan 80:20 v
v ⁄ , 70:30 v v
⁄ , 60:40 v v ⁄ . dan 50:50 v v
⁄ .
3.3.3 Memperoleh Ekstrak Pekat Metanol dari Daun Tumbuhan Jambu Air
Syzygium aquea Burm.f. Alston
Serbuk daun tumbuhan jambu air ditimbang sebanyak 1230 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 7 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama
Universitas Sumatera Utara
± 24 jam. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan
hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tanin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian
dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana.
Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol.
Fraksi metanol dihidrolisa dengan menggunakan HCl 6. Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan kloroform secara berulang-ulang.
Ekstrak kloroform dipekatkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 1,85 g.
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel dan
fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10
v v
⁄ , 80:20 v v ⁄ , 70:30 v v
⁄ , 60:40 v v ⁄ dan 50:50 v v
⁄ .
Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga
homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksan 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 1,85
g ekstrak metanol daun tumbuhan jambu air ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksan : etil asetat 90:10
v v
⁄ secara perlahan – lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran
dengan menambahkan fasa gerak n-heksan : etil asetat dengan perbandingan 80:20vv , 70:30vv, 60:40vv dan 50:50 vv. Hasil yang diperoleh ditampung
dalam botol vial setiap 12 ml , lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk kristal.
Universitas Sumatera Utara
3.3.5 Pemutusan Gula dari Senyawa Flavonoida
Pemutusan gula dari senyawa flavonoida dilakukan dengan cara hidrolisis asam menggunakan HCl 2 N sambil dipanaskan kemudian dipartisi dengan kloroform.
Senyawa yang diperoleh dari kolom kromatografi dilarutkan dengan metanol kemudian dihidrolisa dengan menggunakan HCl 2N lalu dipanaskan selama ± 1 jam
dan disaring. Filtrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan kloroform secara berulang-ulang. Lapisan kloroform diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat
kloroform sebanyak 1,03 g.
3.3.6 Pemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Pemurnian senyawa flvonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif dilakukan karena hasil analis KLT dari kristal yang diperoleh dengan kromatografi kolom
menunjukkan hasil yang belum murni.
Ekstrak pekat kloroform dilarutkan kembali dengan kloroform lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum
sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai untuk Kromatomatografi Lapis Tipis Preparatif. N-heksan : Etil asetat 80:20
v v
⁄ adalah fasa gerak yang menunjukkan pemisahan paling baik untuk selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana KLT
preparatif. Selanjutnya kristal yang telah dilarutkan tadi ditotolkan secara perlahan- lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Plat
dimasukkan kedalam bejana berisi pelarut yang telah dijenuhkan kemudian ditutup. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan hasilnya diperiksa
dibawah sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan digerus dari plat lalu dielusi dengan methanol : etil asetat 1:1. Hasil elusi diuapkan hingga terbentuk kristal.
Universitas Sumatera Utara
3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi
3.3.7.1 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana : eti asetat 80:20 vv.
Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi lapis tipis, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan
kloroform pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi lapis tipis yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai
batas atas, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid.
3.3.7.2 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan kedalam melting point apparatus lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan
menggunakan metanol sebagai pelarut.
Universitas Sumatera Utara
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan
menggunakan metanol sebagai pelarut.
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H- NMR
Analisa dengan alat spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan CDCl
3
sebagai pelarut.
32
Universitas Sumatera Utara
Serbuk daun tumbuhan jambu air Syzygium aquea Burm.f. Alston
Diekstraksi maserasi dengan metanol Disaring
Dipekatkan Dibagi kedalam 4 tabung reaksi
Tabung I Tabung II
Tabung III Tabung IV
Ditambahkan pereaksi
FeCl
3
5 Diamati
perubahan warna
Larutan hitam Ditambahkan
pereaksi NaOH 10
Diamati perubahan
warna
Larutan biru violet Ditambahkan
pereaksi H
2
SO
4p
Diamati perubahan
warna
Larutan merah muda Ditambahkan
pereaksi Mg-HCl
Diamati perubahan
warna
Larutan orange kekuningan
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
3.4.1 Ekstraksi maserasi dengan Metanol
Universitas Sumatera Utara
Serbuk daun tumbuhan jambu air Syzygium aquea Burm.f. Alston
Diekstraksi maserasi dengan etil asetat Disaring
Dipekatkan Dibagi kedalam 4 tabung reaksi
Tabung I Tabung II
Tabung III Tabung IV
Ditambahkan pereaksi
FeCl
3
5 Diamati
perubahan warna
Larutan hitam Ditambahkan
pereaksi NaOH 10
Diamati perubahan
warna
Larutan biru violet Ditambahkan
pereaksi H
2
SO
4p
Diamati perubahan
warna
Larutan merah muda Ditambahkan
pereaksi Mg-HCl
Diamati perubahan
warna
Larutan orange kekuningan
3.4.2 Ekstraksi maserasi dengan Etil asetat
34
Universitas Sumatera Utara
1230 gram serbuk daun tumbuhan jambu air Syzygium aqueaBurm.f.Alston
diskrining fitokimia dimaserasi dengan metanol sebanyak 7 L
didiamkan selama ± 24 jam dilakukan sebanyak 4 kali
disaring Ekstrak metanol
Residu diskrining fitokimia
Ekstrak pekat metanol diuapkan hingga semua metanol menguap
dilarutkan dengan etil asetat disaring
Ekstrak etil asetat Endapan
diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak pekat etil asetat diuapkan hingga semua etil asetat menguap
dilarutkan dengan metanol diekstraksi partisi dengan n-heksana berulang ulang sampai bening
Lapisan metanol Lapisan n-heksana
tidak dilanjutkan diskrining fitokimia
dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan hingga pekat
dilakukan uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict + dihidrolisis dengan HCl 6 sambil dipanaskan selama 1 jam
didinginkan disaring
Ekstrak metanol asam Residu
diekstraksi partisi dengan kloroform Lapisan kloroform
Lapisan metanol asam dipekatkan
Ekstrak pekat kloroform diskrining fitokimia
diuji Kromatografi Lapis Tipis dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak eluen n-heksana:etil asetat
90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50
v v
ditampung tiap fraksi sebanyak ± 12 mL dalam botol vial digabung fraksi dengan Rf yang sama
diuji Kromatografi Lapis Tipis dipekatkan dengan rotarievaporator
diskrinig fitokimia
3.5 Bagan Penelitian
Lanjutan
35
Universitas Sumatera Utara
Fraksi 9-23 90:10
Fraksi 24-38 80:20
Fraksi 39-53 70:30
Fraksi 54-97 60:40
diuji FeCl
3
5 diuji
FeCl
3
5 diuji
FeCl
3
5 diuji
FeCl
3
5 Hasil negatif
Hasil positif Hasil positif
Hasil positif dianalisis Kromatografi Lapis Tipis
dipreparatif dengan eluen n-heksan:etil asetat 80:20 vv
dikeringkan disinari di bawah lampu UV
digerus dari plat dilarutkan dengan campuran metanol : etil asetat 1:1
disaring Senyawa murni
dianalisis Kromatografi Lapis Tipis diuapkan
dianalisis dengan spektrofotmeter UV-Vis,
spektrofotometer Inframerah FT-IR, spektrometer
1
H-NMR Hasil Analisis
Fraksi 98-143 50:50
Hasil positif diuji
FeCl 5 36
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
Dari hasil skrining pendahuluan terhadap ekstrak metanol dan etil asetat dari daun tumbuhan jambu air dengan adanya penambahan pereaksi-pereaksi warna untuk
menentukan golongan senyawa kimia yang dikandung dengan menggunakan pereaksi flavonoida ternyata sampel positif mengandung flavonoida.
Hasil isolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan jambu air berupa kristal berwarna kuning dengan berat 7 mg dan harga Rf 0,35 diperoleh dengan
menggunakan fasa gerak n-heksana:etil asetat 80:20 vv. Spektrum UV-Visible senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut metanol
ditunjukkan pada gambar 4.1 dibawah ini :
Gambar 4.1 Spektrum UV-Visibel Senyawa Hasil Isolasi 1.
Pita I memberikan panjang gelombang 310,0 nm 2.
Pita II memberikan panjang gelombang 290,0 nm
Universitas Sumatera Utara
Hasil analisis spektrofotometer FT-IR dari kristal hasil isolasi menghasilkan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang yang dapat dilihat pada Gambar 4.2.
O HO
OCH
3
CH
3
CH
3
O 3
4 5
6 7
2 8
1 2
3 4
5 6
1
A C
B
Gambar 4.2 Spektrum Inframerah FT-IR Senyawa Hasil Isolasi Hasil analisis Spektrofotometer FT-IR pada pasta hasil isolasi menghasilkan pita-pita
serapan pada daerah bilangan gelombang sebagai berikut: 1.
Pada bilangan gelombang 3429,43-3390,86 cm
2. Pada bilangan gelombang 3236,55-3192,19 cm
-1
3. Pada bilangan gelombang 2956,87-2933,73 cm
-1
4. Pada bilangan gelombang 1639,49 cm
-1
5. Pada bilangan gelombang 1504,48 cm
-1
6. Pada bilangan gelombang 1456,26 cm
-1
7. Pada bilangan gelombang 1369,46 cm
-1
8. Pada bilangan gelombang 1274,95 cm
-1 -1
Universitas Sumatera Utara
9. Pada bilangan gelombang 1165,00 cm
10. Pada bilangan gelombang 1022,27 cm
-1
11. Pada bilangan gelombang 916,19 cm
-1 -1
Hasil analisis Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
O CH
3
HO
O
1 2
4 5
6 2
4 6
7 8
1
A
B
C
3
CH
3
OCH
3
5 3
H
2
H
6
H
2
H
5
H
6
H
8
OCH
3
H
eq
H
ax
CH
3
CH
3
H3eq H3ax
H-NMR memberikan pergeseran kimia pada daerah ppm seperti gambar.
Gambar 4.3 Spektrum
1
1. δ = 2,1404 ppm menunjukkan puncak singlet
H-NMR Senyawa Hasil Isolasi
2. δ = 2,1832 ppm menunjukkan puncak singlet
3. δ = 2,7708 - 28110 ppm menunjukkan puncak doublet doublet
4. δ = 3,1470 - 3,1855 ppm menunjukkan puncak doublet doublet
5. δ = 3,6113 ppm menunjukkan puncak singlet
Universitas Sumatera Utara
6. δ = 5,5453 - 5,5648 ppm menunjukkan puncak doublet doublet
7. δ = 5,9578 - 59889 ppm menunjukkan puncak doublet
8. δ = 7,4300, 7,4456 dan 7,4598 ppm menunjukkan puncak triplet
9. δ = 7,5545-7,5688 ppm menunjukkan puncak doublet
3.5 Pembahasan