commit to user 27
4. Variabel Pengganggu Tak Terkendali Kecepatan Pertumbuhan Candida albicans dipengaruhi oleh
struktur genetik sel jamur yang sulit untuk dikendalikan.
H. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat Alat yang digunakan adalah sebagai berikut :
a. Cawan petri berdiameter 10 cm b. Oshe kolong
c. Tabung reaksi d. Becker glass
e. Pipet f. Mikropipet 20-200 µL dan 0,5-10 µL dengan tip yang sesuai
g. Alat pembuat sumuran berdiameter 6 mm h. Lampu spiritus
i. 0,5 standar Mc Farland j. Autoklaf
k. Inkubator l. Penggaris dengan ketelitian 1 mm
2. Bahan Bahan yang digunakan adalah sebagai berikut :
commit to user 28
a. Biakan koloni Candida albicans b. Minyak atsiri rimpang lengkuas berbagai konsentrasi
c. Minyak atsiri kulit batang kayu manis berbagai konsentrasi d. Saborrud Dextrose Agar SDA
e. Akuades f. NaCl 0,9
g. Kloramfenikol 250 mg dalam kapsul h. Etanol 70
i. Flukonazol merk dagang diflucan dengan kadar 50 mg
I. Cara Kerja
1. Pembuatan Minyak Atsiri a. Kulit batang kayu manis yang diperoleh di Pasar Beringharjo,
Yogyakarta diserbuk kasar lalu ditimbang sebanyak 4.617 gram. Setelah itu dimasukkan ke dalam dandang destilasi yang telah diisi air
sebanyak 9 liter, dirangkai dengan pendingin air dan penampung destilat. Kemudian dipanaskan dengan kompor LPG api sedang,
pemanasan dihentikan setelah 6 jam sejak destilat pertama menetes lalu didinginkan. Dari proses ini, dihasilkan minyak atsiri kulit batang kayu
manis dengan volume 4,5 ml. b. Rimpang lengkuas yang didapatkan di Desa Margoagung, Seyegan,
Kabupaten Sleman dicuci, diiris dengan ketebalan ± 5 mm, lalu ditimbang sebanyak 5.803 gram. Setelah itu dimasukkan ke dalam
commit to user 29
dandang destilasi yang telah diisi air sebanyak 7 liter, dirangkai dengan pendingin air dan penampung destilat. Kemudian dipanaskan dengan
kompor LPG api sedang, pemanasan dihentikan setelah 6 jam sejak destilat pertama menetes lalu didinginkan. Dari proses ini, dihasilkan
minyak atsiri rimpang lengkuas dengan volume 7,4 ml.
2. Preparasi Media Pembiakan a. Untuk setiap 1 L akuades dibutuhkan 65 gr bubuk agar SDA.
b. Cawan petri yang digunakan adalah 3 cawan petri berdiameter 10 cm dan 1 cawan petri berdiameter 5 cm. Larutan agar dituang ke dalam
cawan petri hingga tebalnya mencapai 4 mm. c. Preparasi SDA:
Perhitungan jumlah larutan agar yang dibutuhkan untuk satu kali percobaan pada cawan petri berdiameter 10 cm:
z =
R
= · 5
R
· 0,4 cm
3
» 31,43 cm
3
Û 31,43 ml Satu cawan petri membutuhkan 31,43 ml larutan SDA, sehingga untuk
3 cawan dibutuhkan 94,29 ml larutan SDA. Untuk cawan petri berdiameter 5 cm:
z =
R
= · 2,5
R
· 0,4 cm
3
» 7,86 cm
3
Û 7,86 ml
commit to user 30
Setiap cawan dituangkan 7,86 ml larutan SDA. Total untuk 1 kali percobaan dibutuhkan 102,15 ml larutan agar
SDA. Dibuat dengan cara melarutkan 6,64 gram bubuk SDA ke dalam 102,15 ml akuades.
d. Preparasi Larutan Kloramfenikol Penambahan larutan kloramfenikol ke dalam media SDA
bertujuan untuk mencegah tumbuhnya kuman kontaminan. Setiap 1000 ml larutan SDA membutuhkan 400 mg kloramfenikol. Sehingga untuk
102,15 ml
larutan SDA
dibutuhkan:
ą6R,ąō ą666
x 400 mg = 40,86 mg kloramfenikol Bridson, 1998.
Setiap 250 mg bubuk kloramfenikol yang didapatkan dari kapsul kloramfenikol 250 mg dilarutkan ke dalam 10 ml NaCl 0,9.
Maka untuk
40,86 mg
bubuk kloramfenikol,
dibutuhkan:
6, Rō6
x 10 ml = 1,63 ml akuades Bridson, 1998. e. Media SDA yang masih cair kemudian dibiarkan mendingin, lalu
disterilisasi di dalam autoklaf pada suhu 118
o
C – 121
o
C selama 15 menit.
3. Preparasi Flukonazol Flukonazol yang digunakan didapat dari kapsul dengan merk
dagang diflucan yang mengandung 50 mg flukonazol. Hasil penelitian
commit to user 31
Peter 1996 menunjukkan bahwa flukonazol pada konsentrasi 25 µg merupakan konsentrasi optimal untuk menghambat pertumbuhan spesies
Candida albicans secara in vitro. Sehingga dalam penelitian ini digunakan dosis dengan konsentrasi 25 µg. Akuades yang dibutuhkan untuk
mendapatkan flukonazol konsentrasi 25 µg adalah:
ą
z
ą
=
R
z
R
25 µg · z
ą
= 50 mg · 0,05 ml z
ą
=
ō6.666 6,6ō
Rō
z
ą
= 100 ml
4. Pengenceran Minyak Atsiri a. Minyak atsiri dari kulit batang kayu manis dan rimpang lengkuas dan
campuran minyak atsiri dengan konsentrasi 100 diencerkan dengan etanol 70. Penelitian ini menggunakan etanol 70 sebagai pengencer
minyak atsiri, karena minyak atsiri mudah larut dalam etanol 70, eter, eter minyak tanah, kloroform serta minyak lemak Hargono et al.,
1986 b. Larutan minyak atsiri dengan berbagai konsentrasi didapatkan dengan
perhitungan sesuai turunan persamaan pengenceran
ą
z
ą
=
R
z
R
, yaitu:
z
ą
=
N
1
= kadar flukonazol akhir N
2
= kadar flukonazol awal V
1
= volume awal V
2
= volume akhir
N
1
= kadar minyak atsiri awal N
2
= kadar minyak atsiri akhir V
1
= volume awal V
2
= volume akhir
commit to user 32
c. Sebanyak 0,2 ml minyak atsiri 1 didapatkan dengan cara mencampur 2×10
-3
ml minyak atsiri 100 dengan 1,98×10
-1
ml etanol 70. Diperoleh dari
z
ą
=
ą 6,R ą66
= 2×10
-3
ml d. Sebanyak 0,2 ml minyak atsiri 4 didapatkan dengan cara mencampur
8×10
-3
ml minyak atsiri 100 dengan 1,92×10
-1
ml etanol 70. Diperoleh dari
z
ą
=
6,R ą66
= 8×10
-3
ml e. Sebanyak 0,2 ml minyak atsiri 8 didapatkan dengan cara mencampur
1,6×10
-2
ml minyak atsiri 100 dengan 1,84×10
-1
ml etanol 70. Diperoleh dari
z
ą
=
6,R ą66
= 1,6×10
-2
ml f. Sebanyak 0,2 ml minyak atsiri 12 didapatkan dengan cara
mencampur 2,4×10
-2
ml minyak atsiri 100 dengan 1,76×10
-1
ml etanol 70. Diperoleh dari
z
ą
=
ąR 6,R ą66
= 2,4×10
-2
ml g. Sebanyak 0,2 ml minyak atsiri 16 didapatkan dengan cara
mencampur 3,2×10
-2
ml minyak atsiri 100 dengan 1,68×10
-1
ml etanol 70. Diperoleh dari
z
ą
=
ą 6,R ą66
= 3,2×10
-2
ml
5. Penghitungan Besaran Ulangan Percobaan
commit to user 33
Seluruh rangkaian percobaan diulangi sebanyak 4 kali pada uji penelitian. Jumlah pengulangan didapatkan dengan rumus Federer :
− 1 − 1 ≥ 15 18
− 1 − 1 ≥ 15 17
− 17 ≥ 15 ≥ 1,88
Jumlah ulangan percobaan yang dilakukan minimal 1,88 kali. Pada penelitian kali ini, peneliti melakukan ulangan percobaan sebanyak 4 kali.
Peneliti tidak melakukan uji pendahuluan karena telah ada penelitian sebelumnya yang menguji efek antifungi dari minyak atsiri kulit
batang kayu manis dan rimpang lengkuas secara terpisah. Hasil yang didapatkan dari kedua penelitian itu menunjukkan bahwa KHM minyak
atsiri kayu manis sebesar 1 dan rimpang lengkuas sebesar 8 Sukandar, 1999; Soeratri, 2005. Oleh karena itu, penelitian ini
menggunakan konsentrasi minyak atsiri yang dimulai dari 1 dan menyinggung 8.
6. Uji Penelitian a. Kultur koloni jamur Candida albicans berusia 2 hari diambil dengan
oshe kolong lalu dilarutkan ke dalam NaCl 0,9. Kekeruhannya distandarkan dengan 0,5 standar Mc Farland yang ekuivalen dengan
kekeruhan larutan campuran antara 0,5 ml BaCl2•2H2O 1,175 dan 99,5 ml H2SO4 1 Jorgensen, Turnidge, Washington, 1999.
k : jumlah perlakuan n : jumlah ulangan
commit to user 34
b. Suspensi Candida albicans diambil sebanyak 0,2 ml. Lalu diteteskan ke atas permukaan cawan petri. Suspensi jamur diratakan dengan cara
menggoyang-goyangkan cawan petri dan usapan oshe kolong Asiyani, 2008.
c. Untuk cawan petri diameter 5 cm, dibuat 2 buah sumuran berdiameter 6 mm. Pada sumuran pertama diisi 0,05 ml etanol 70 sebagai kontrol
negatif dan pada lubang kedua diisi 0,05 ml larutan flukonazol 25 µg sebagai kontrol positif. Etanol 70 dipilih sebagai kontrol negatif
karena tidak memiliki efek antifungi. Ini dibuktikan oleh tidak adanya zona hambat pada sumuran kontrol negatif yang diisi dengan etanol
70. Sedangkan pada sumuran yang berfungsi sebagai kontrol positif yang diisi dengan larutan flukonazol 25 µg, terdapat zona hambatan
yang berarti. Flukonazol telah terbukti bekerja tepat dan efektif untuk pengobatan infeksi jamur superfisial dan sistemik Adiguna, 2000.
d. Pada tiga cawan petri diameter 10 cm, masing-masing dibuat 5 buah sumuran berdiameter 6 mm.
e. Ke dalam 5 sumuran pada cawan petri I, masing-masing diisi 0,05 ml larutan minyak atsiri kulit batang kayu manis konsentrasi 1, 4, 8,
12 dan 16. f. Ke dalam 5 sumuran pada cawan petri II, masing-masing diisi 0,05 ml
larutan minyak atsiri rimpang lengkuas konsentrasi 1, 4, 8, 12 dan 16.
commit to user 35
g. Ke dalam 5 sumuran pada cawan petri III, masing-masing diisi 0,05 ml campuran larutan minyak atsiri kulit batang kayu manis dan rimpang
lengkuas konsentrasi 1, 4, 8, 12 dan 16. h. Seluruh cawan petri lalu disimpan di dalam inkubator pada suhu 37
o
C selama 24 jam.
i. Pengukuran diameter zona hambatan dalam satuan mm dengan menggunakan penggaris dengan ketelitian hingga 1 mm, termasuk
diameter lubang sumuran Pepeljnjak et al., 2005.
J. Teknik Analisis Data