Pembentukan Dan Penghitungan Sel Biofilm A. salmonicida Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat

3.8. Produksi Senyawa Antimikroba BAL

Produksi Senyawa Antimikroba dilakukan dengan memproduksi senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL yang berasal dari kultur cair berumur 15 jam. Kultur cair MRS ditambahkan sebanyak 10 mL ke dalam 400 mL media NB, diinkubasi pada suhu 28 C selama 15 jam. Kemudian sebanyak 100 mL kultur disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan penyaringan senyawa antimikroba dengan kertas saring 0,22 µm MS ® Syringe filter sehingga diperoleh ekstrak kasar senyawa antimikroba BAL.

3.9. Uji Aktivitas Senyawa Antimikroba BAL terhadap bakteri patogen A. salmonicida.

Pengujian terhadap bakteri patogen dilakukan dengan menyebarkan suspensi kultur bakteri uji di atas media MHA. Kertas cakram ditetesi dengan senyawa antimikroba sebanyak 3 0 μl dan diletakkan di atas sebaran biakan patogen uji dengan OD 600 =0,5, lalu diinkubasi pada suhu 28-30 °C selama tiga hari. Pengamatan dilakukan terhadap pengukuran zona hambat yang terbentuk di sekitar cakram kertas yang menunjukkan adanya aktivitas antimikroba. Kertas cakram kloramfenikol 10 μg digunakan sebagai pembanding dengan senyawa antmikro. Pengujian kemampuan senyawa antimikrob dilakukan dengan metode difusi cakram.

3.10. Pembentukan Dan Penghitungan Sel Biofilm A. salmonicida

Lempeng permukaan padat dibuat untuk pengujian in vitro dalam hal ini permukaan plastik PVC dan sisik ikan. Lempeng plastik PVC dan sisik ikan dipotong seluas 1 cm 2 kemudian dicuci dengan larutan detergen pada bak sonikator selama 15 menit. Kedua lempeng lalu di autoklaf selama 15 menit, tekanan 1 atm pada suhu 121 C. Sisik ikan dan PVC dianalogikan sebagai permukaan padat di kolam ikan. Isolat murni A. salmonicida ditumbuhkan pada media NB sebanyak 50 ml dengan konsentrasi sel 10 8 CFUml dalam labu erlenmeyer. Secara terpisah masing-masing lempeng dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer, kemudian diaerasi selama 15 menit setiap harinya pada suhu ruang 28 C. Pembentukan biofilm diamati pada periode 1, 3 dan 5 hari untuk melihat penempelan sel biofilm. Lempeng diangkat dari kultur, masing-masing dibilas sebanyak 3 kali dengan 10 ml akuades steril kemudian dimasukkan ke 9 ml larutan garam fisiologis NaCl 0,85 yang ditambah dengan 0,5 g manik-manik kaca mikro glass bead, kemudian dihomogenkan untuk melepas sel biofilm selama 2 menit. Selanjutnya dilakukan pengenceran berseri. Sebanyak 0,1 ml kultur disebar pada media PCA, diinkubasi pada suhu 28 C selama 24 jam. Setelah itu dilakukan perhitungan jumlah sel dengan metode TPC. Perlakuan diulang sebanyak 2 kali. Kontrol berupa larutan yang berisi masing-masing lempeng tanpa penambahan sel A. salmoncida menurut metode Jamilah dan Priyani, 2012.

3.11. Pengendalian Sel Biofilm A. salmonicida dengan Senyawa Antimikrob BAL Potensial

Lempeng plastik PVC dan sisik ikan yang telah ditumbuhi biofilm A. salmoncida yang berumur 1, 3, dan 5 hari disiapkan. Masing-masing lempeng plastik PVC dan sisik ikan yang terpisah dimasukkan ke dalam tabung steril yang berbeda lalu ditambahkan masing-masing senyawa antimikrob BAL terpilih pada suhu 28 C dengan waktu kontak 1 jam dan diaerasi selama 15 menit. Setelah waktu kontak 1 jam lempeng diangkat dari kultur dan masing-masing dibilas sebanyak 3 kali dengan 10 ml akuades steril lalu dimasukkan ke 9 ml larutan garam fisiologis NaCl 0,85 yang ditambah dengan 0,5 g manik-manik kaca mikro glass bead, kemudian dihomogenkan untuk melepas sel biofilm selama 2 menit, selanjutnya dilakukan pengenceran berseri. Sebanyak 0,1 ml kultur disebar pada media PCA secara aerobik, kemudian diinkubasi pada suhu 28 C selama 24 jam, dilakukan perhitungan jumlah sel dengan metode TPC. Perlakuan diulang sebanyak 2 kali.

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat

Hasil isolasi BAL yang diisolasi dari usus ikan mas diperoleh 6 isolat bakteri yaitu UM1, UM2, UM3, UM4, UM5, dan UM6 yang berbeda dari segi warna, bentuk, tepian dan elevasi koloni. Beberapa isolat BAL yang diujikan dalam penelitian ini diperoleh dari stok kultur laboratorium Mikrobiologi Universitas Sumatera Utara yang diisolasi dari usus ikan nila oleh Harahap et al., 2013 yaitu US7. Isolat AK1, AK3, dan AK5 diisolasi dari air kolam oleh Mayasari et al., 2013, sedimen kolam 2 isolat yaitu EK2 dan EK5 yang diisolasi oleh Sitepu et al., 2013 juga digunakan dalam penelitian ini. Isolat yang berbeda dipisahkan dengan menggunakan metode cawan gores pada media MRSA sehingga diperoleh biakan murni untuk keperluan karakterisasi. Berdasarkan pengamatan morfologi isolat BAL yang diperoleh dari usus ikan mas bervariasi umumnya bentuk koloni bulat, tidak beraturan dan cekung. Tepi koloni umumnya tidak teratur namun beberapa ada yang halus dan bergelombang. Warna koloni BAL umumnya putih susu dan krem. Elevasi dari koloni BAL hasil isolasi juga bervariasi diantaranya datar, berbukit dan timbul Tabel 4.1. Hasil pewarnaan Gram pada seluruh isolat BAL merupakan bakteri Gram positif. Bakteri gram positif mempunyai dinding sel yang tebal tersusun dari lapisan peptidoglian yang terdri atas protein, asam teikoat, dan polisakarida serta bagian luar dielilingi dan dibungus oleh lapisan sulfur protein Capucino dan Sherman, 2001. Berdasarkan pengamatan terhadap hasil uji biokima, secara umum isolat bakteri asam laktat menunjukkan uji negatif terhadap hidrolisis pati, uji sitrat dan hidrolisis gelatin. Pada uji katalase bakteri asam laktat postif namun beberapa negatif yaitu UM3, UM5, AK5 dan EK2. Pada uji motilitas UM5 dan UM6 berbentuk pedang dan terdapatnya endapan hitam. Tabel 4.1. Karakteristik morfologi dan Biokimia Isolat BAL Kode Isolat Morfologi koloni G ram B ent uk Uji biokimia E nda pa n R et aka n G ela tin K at al as e M ot ilita s Pati Sitrat UM1 UM2 UM3 UM4 UM5 UM6 AK1 AK3 AK5 EK2 EK5 US7 Putih susu, bulat, utuh, datar Krem, bulat, utuh, datar Krem, tidak teratur, gelombang, datar Putih, bulat, utuh, datar Krem, cekung, gerigi,cembung Putih, bulat, gerigi, datar Putih susu, bulat, tidak teratur, timbul Krem, bulat, tidak teratur, timbul Putih susu, bulat, halus, timbul Putih susu, bulat, halus, timbul Putih susu, bentuk -I, gerigi, timbul Krem, filiform, lobat, umbonat + + + + + + + + + + + + Kokus Kokus Kokus Kokus Kokus Kokus Kokus Kokus Basil Kokus Basil Kokus - - - - - - - - - - - - - - - - + - + - + - - - - - - - - - - - - - - - + + - + - + + + - - + + - - - - + + - - - - + + - + - - + - - - - - - - - - - - + + - - - - - - Keterangan: UM = Usus ikan Mas AK = Air Kolam EK = Endapan Kolam US = Usus ikan Nila Bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri probiotik yang dapat memberikan efek yang menguntungkan bagi kesehatan inangnya dengan cara meningkatkan sifat-sifat dari mikroflora dalam saluran pencernaan. Spesies mikroba yang umum digunakan sebagai probiotik adalah Lactobacillus, Bifidobacteria, Enterococcus, Saccharomyces, dan Lactococcus. Menurut Cowan 1974 bahwa bakteri probiotik merupakan bakteri berbentuk batang, beberapa berbentuk kokus, tergolong bakteri Gram positif pada kultur muda dan akan menjadi bakteri Gram negatif ketika memasuki fase stasioner dalam pertumbuhannya, bersifat motil, memproduksi spora endospora yang biasanya resisten pada panas, aerob beberapa spesies anaerob fakultatif, katalase positif dan oksidasi bervariasi. Namun beberapa spesies dapat membentuk katalase atau sitokrom pada media yang mengandung hematin atau senyawa terkait dan beberapa lactobacilli juga dapat menghasilan non-heme katalase yang dissebut pseudocatalase, yang menyebaban kebingungan untuk identifikasi BAL Holzapel et al., 2001. 4.2. Seleksi Bakteri Asam Laktat Potensial dalam Menghambat Bakteri Patogen Aeromonas salmonicida dengan Difusi Cakram Hasil seleksi isolat BAL yang potensial memperlihatkan bahwa terdapat hasil yang bervariasi dalam menghambat mikroba patogen Aeromonas salmonicida. Sembilan isolat mampu menghambat mikroba uji Aeromonas salmonicida yaitu isolat UM1, UM2, UM3, UM4, UM5, UM6, AK1, EK5 dan EK2 sedangkan 3 isolat lainnya yaitu US7, AK3 dan AK5 tidak mampu menghambat mikroba uji Aeromonas salmonicida. UM1 memiliki luas zona hambat terbesar pada Aeromonas salmonicida sebesar 8,35 mm. UM4 memiliki zona hambat terbesar kedua dalam menghambat Aeromonas salmonicida sebesar 7,6 mm. Isolat UM1 dan UM4 ini dikategorikan memiliki zona hambat yang tergolong kuat. Menurut Pan et al 2009, zona bening yang berdiameter hambat 0-3 mm tergolong lemah, diameter hambat 3-6 mm tergolong baik, diameter hambat lebih besar dari 6 mm tergolong kuat. Hasil uji antagonis isolat BAL terpilih terhadap Aeromonas salmonicida dan dapat dilihat pada Tabel 4.2. Tabel 4.2. Uji Antagonis Isolat BAL terhadap Mikroba Patogen Aeromonas salmonicida Kode Besar Zona Hambat Terhadap Isolat A. salmonicida mm Hari ke- 1 Hari ke- 2 UM1 7,7 8,35 UM2 7.56 7,59 UM3 7,24 7,13 UM4 7,58 7,6 UM5 7,21 6,17 UM6 7,45 7,5 AK1 7,4 7,48 EK5 7,43 7,52 US7 EK2 7,42 7,35 AK3 AK5 Tabel 4.2 terlihat bahwa aktivitas antagonistik terhadap bakteri patogen uji Aeromonas salmonicida oleh bakteri asam laktat ternyata menunjukkan kemampuan menghambat yang berbeda. Adanya perbedaan ukuran zona hambat pada setiap isolat BAL mungkin disebabkan senyawa antibakteri yang dihasilkan pada setiap isolat berbeda sehingga berpengaruh terhadap ukuran zona bening yang terbentuk. Bakteri asam laktat yang mengandung probiotik misalnya Lactobacillus spp. menghasilkan enzim-enzim pencernaan seperti lactase yang memanfaatkan karbohidrat yang tidak dapat dicerna menjadi dapat dicerna serta dapat meningkatkan kekebalan tubuh. Bacillus sp. dimanfaatkan sebagai agen biokontrol probiotik karena memiliki kemampuan dalam mendegradasi senyawa organik dan menggunakannya untuk menunjang pertumbuhannya. Hal ini disebabkan karena, Bacillus sp. memiliki enzim proteolitik yang dihasilkan secara ekstraseluler yang berperan dalam menguraikan protein dan juga memiliki enzim lipolitik yang berperan dalam menguraikan lemak sehingga mampu mendegradasi sampah-sampah organik yang dipecah menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana Mansyur et al., 2008. Beberapa hasil penelitian menunjukkan hasil berbeda yang diiisolasi dari keju oleh Susanti et al., 2007 pengujian senyawa aktivitas antagonistik terhadap S. aureus isolat KJ-1 yang diisolasi dari keju menunjukkan aktivitas penghambatan yang terbesar yaitu 5,5 mm dengan metoda difusi agar, sedangkan Lactobacillus mesenteroides FNCC023 memberikan penghambatan yang kecil terhadap B. cereus yaitu sebesar 4,0 mm. Lactobacillus mesenteroides FNCC023 memberikan penghambatan yang kecil terhadap E. coli yaitu sebesar 3,8 mm. Gambar 4.1. Uji Antagonis Isolat BAL Terhadap Mikroba Patogen Aeromonas salmonicida a Isolat UM1 selama 48 jam b Isolat UM4 selama 48 jam. Pada isolat UM3, UM5 dan EK2 terhadap Aeromonas salmonicida diperoleh data zona hambat yang menurun pada hari kedua. Hal ini dapat disebabkan karena beberapa faktor, antara lain yaitu tidak dihasilkan lagi metabolit sekunder dalam menghambat pertumbuhan mikroba uji. Selain itu juga tergantung dari sifat isolat bakteri, baik bersifat bakteriostatik maupun bakteriosidal. Beberapa isolat tidak mampu menghambat patogen uji dugaan yang menyebabkan isolat tersebut tidak mampu menghambat mikroba patogen yang diuji yaitu isolat bakteri tersebut menghasilkan senyawa antibakteri namun tidak bersifat aktif terhadap bakteri uji Aeromonas salmonicida. Bakteri menghasilkan senyawa antibakteri secara intraseluler sehingga senyawa antibakteri yang b a a dihasilkan oleh bakteri tersebut tidak terekskresi dan terakumulasi dalam media tumbuh. Dari hal ini dapat diketahui bahwa setiap isolat bakteri asam laktat yang diperoleh menghasilkan metabolit dan kemampuan menghambat yang berbeda- beda pada beberapa mikroba patogen. Verschuere et al., 2000 mengemukakan bahwa mekanisme bakteri antagonis yang dapat digunakan sebagai biokontrol adalah menghasilkan senyawa penghambat pertumbuhan patogen, terjadi kompetisi pemanfaatan senyawa tertentu atau kompetisi pemanfaatan energi dan kompetisi tempat menempel. Aktivitas antibakteri terbentuk setelah memasuki fase stasioner mengikuti mekanisme quorum sensing yang merupakan sistem komunikasi antar sel dalam merespon perubahan lingkungan. Pembentukan senyawa metabolit ini merupakan suatu bentuk respon bakteri untuk pertahanan melawan mikroba lain Abee et al., 2011; Whitehead et al., 2001; Tinaz, 2003. Selain itu juga faktor yang mempengaruhi pembentukan metabolit yaitu nutrien dan laju pertumbuhan bakteri.

4.3. Kurva Pertumbuhan BAL Potensial