DETEKSI RESISTENSI INH (gen inhA) PADA PENDERITA TUBERCULOSIS KASUS BARU DENGAN MENGGUNAKAN KULTUR CAIR MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) DAN METODE PCR (Polymerase Chain Reaction)

  

DETEKSI RESISTENSI INH (gen inhA) PADA PENDERITA TUBERCULOSIS KASUS

BARU DENGAN MENGGUNAKAN KULTUR CAIR MGIT (Mycobacteria Growth Indicator

Tube) DAN METODE PCR (Polymerase Chain Reaction)

_{(1) (2) (1) 1)} Sitti Romlah , Rina Heryawan , Siti Rezki

  Prodi Analis Kesehatan, Stikes Jenderal Achmad Yani, Jalan Terusan Jenderal Sudirman Cimahi ₂₎

  RSP dr. H.A Rotinsulu , Jl. Bukit Jarian N0 40 Ciumbuleuit Bandung Email :

  

ABSTRAK

  Tuberculosis (TB) adalah suatu penyakit menular yang disebabkan bakteri Mycobacterium tuberculosis yang sebagian besar menyerang paru tetapi dapat juga mengenai organ tubuh lain. Terjadinya resistensi kuman M. tuberculosis terhadap obat anti tuberculosis (OAT) menimbulkan masalah untuk penatalaksanaan TB karena resiko penularan yang tinggi sehingga menyebabkan M. tuberculosis menjadi semakin virulen.Terjadinya mutasi pada gen inhA yang berperan dalam mengkode enzim ACP

  

reductase akan menyebabkan terjadinya resistensi terhadap INH. Penelitian ini bertujuan untuk

  mengetahui adanya pita DNA gen inhA penyebab resistensi terhadap INH dengan metode PCR dan elektroforesis dari sampel kultur cair MGIT sehingga didapatkan tingkat sensitivitas dan spesifisitas metode PCR. Sampel penelitian diambil dari semua pasien suspek tuberculosis kasus baru yang ada di Laboratorium Mikrobiologi Rumah sakit Paru Rotinsulu Bandung dengan hasil kultur MGIT positif. Jumlah sampel yang digunakan sebanyak 15 sampel. Kemudian dilakukan isolasi DNA. Setelah didapat isolat DNA dilakukan PCR dan elektroforesis.Hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa terdapat kesesuaian dari 5 sampel yang dinyatakan resisten INH pada tes DST dengan teknik PCR dengan tingkat sensitivitas dan spesifisitas 100%.

  Kata kunci : INH, MGIT, PCR (Polymerase Chain Reaction), tuberculosis

• – negara berkembang termasuk Indonesia. Menurut World Health Organization (WHO), Indonesia merupakan negara dengan kasus TB terbesar ketiga di dunia, setelah Cina dan India. WHO memperkirakan di Indonesia setiap tahunnya terjadi 539.000 kasus baru TB sedangkan TB paru sebesar 236.029 kasus dengan kematian karena TB sekitar 250 orang per hari ( I Made, 2013).
• – akhir ini dilaporkan timbulnya resistensi kuman TB terhadap Isoniazid (INH) dan Rifampicin di Amerika serikat dan negara lainnya di dunia. Terdapatnya resistensi multiple obat terhadap

  , gen ndh, dan gen kasA. Persentase mutasi yang terjadi pada gen inhA yaitu sebesar 15

  ahpC

  Resistensi kuman M. tuberculosis terhadap obat anti tuberculosis terjadi pada umumnya karena mutasi sel kuman pada tingkat gen. Gen yang mengalami mutasi ini berperan untuk mengkode enzim yang menjadi target obat anti tuberculosis. Mekanisme terjadinya resistensi kuman M. tuberculosis terhadap INH secara biomolekuler dipengaruhi oleh mutasi pada beberapa gen, tapi mutasi ini terutama terjadi pada gen katG, gen inhA, gen

  biasanya meliputi beberapa jenis obat yang termasuk dalam “first line drugs” yaitu Isoniazid (INH), Rifampicin, Ethambutol, dan Pyrazinamid. Penyebab utama terjadinya resistensi terhadap obat anti tuberculosis adalah pengobatan yang tidak adekuat dimana pemakaian obat anti tuberculosis yang tidak sesuai dengan aturan baik dari segi dosis, cara pemakaian maupun lamanya penggunaan obat yang akan meyebabkan berkembangnya kuman yang resisten. Namun resistensi terhadap kuman M. tuberculosis juga dapat terjadi secara langsung yaitu jika penderita tertular oleh kuman M. tuberculosis yang telah resisten dari penderita TB yang lain ( Nofriyanda, 2010).

  tuberculosis terhadap obat anti tuberculosis

  Terjadinya resistensi kuman M.

  setidaknya terhadap Isoniazid dan Rifampicin yang merupakan Obat AntiTuberkulosis primer atau lini pertama yang paling efektif (Soewarta, 1997).

• – 43 %, dimana gen inhA ini berperan dalam mengkode enzim enoyl
• – acyl carrier protein

  Drug Resistance ). MDR-TB adalah Mycobacterium tuberculosis yang resisten

  Sedangkan pada tahun 1995 sebanyak 23,97 % kasus resistensi terhadap INH dan sebesar 14,26 % dengan resistensi multi obat (Multi

  Pada tahun 1991, Rumah Sakit Persahabatan Jakarta sebagai rumah sakit rujukan nasional penyakit paru dan memiliki laboratorium mikrobiologi yang diakui sebagai “WHO Collaborating Centre”, melaporkan terjadinya 26,5 % kasus resisten terhadap INH.

  INH sebesar 2,16%, rifampisin 0,50%, resistensi sekunder terhadap INH 5,05 %, rifampisin 2,03 % ( Paul, 1999 ).

  meningkatnya angka kasus baru dan angka kematian serta kurang berhasilnya pengobatan terhadap penyakit TB. Pengobatan terhadap penyakit TB memerlukan waktu yang lama, hal ini merupakan problem kesehatan masyarakat di seluruh dunia. Hasil penelitian Aditama dkk, menunjukkan bahwa resistensi primer terhadap

  Mycobacterium tuberculosis , tercermin pada

  Menurut Rattan (1998 dalam Paul, 1999) angka kematian tiap minggu 52.000 orang atau tiap hari lebih dari 7000 orang yang meninggal. Pengobatan dan kontrol terhadap penyakit TB telah dilakukan, tetapi akhir

  Penyakit Tuberculosis (TB) sampai saat ini masih menjadi masalah kesehatan masyarakat di dunia, dimana diperkirakan terdapat 9 juta penduduk dunia terserang penyakit TB dengan kematian 3 juta jiwa. Penyakit TB ini menjadi masalah terutama di negara

  Pendahuluan

  (ACP) reductase, dan enzim enoyl

• – acyl

  Mycobacteria Growth Indicator Tube ) bisa

• – based oxygen sensor yang ditanam didasar tabung. Pertumbuhan kuman dengan cara ini dapat di deteksi dalam waktu 7
• – 12 hari dan dibaca secara otomatis dengan Bactec MGIT 960 system (Sari, 2007). Jenis spesies yang dapat di deteksi oleh tabung MGIT ini adalah M.

  dengan teknik kultur memiliki sensitivitas 65%, spesifisitas 40% serta akurasi 57% yang berarti tidak ada perbedaan yang bermakna, hal ini dapat diartikan bahwa deteksi M. tuberculosis dengan teknik PCR sama baiknya dengan teknik kultur bakteri M. tuberculosis, namun waktu pemeriksaan dengan teknik PCR lebih singkat dibandingkan dengan kultur kuman M.

  tuberculosis dengan teknik PCR dibandingkan

  Seiring bertambah pesatnya kemajuan teknologi saat ini, yakni teknik atau metode PCR ( Polymerase Chain Reaction ) adalah suatu teknik atau metode pemeriksaan yang prinsip kerjanya memperbanyak (amplifikasi) DNA in vitro secara enzimatis. Pemeriksaan sputum penderita dapat dilakukan dengan tiga teknik pemeriksaan, yaitu dengan teknik PCR, teknik kultur bakteri, dan pemeriksaan BTA secara mikroskopik. Menurut penelitian Diana Krisanti dkk pada tahun 2004, deteksi M.

  africanum , M. avium complex, M. chelone, M. flafecens , M. fortulinum, M. gastri, M. gordone, M. hemophilum , M. kansasii, M. smegmatis, M. tuberculosis dan lain sebagainya (Kusdarmadji, 2000).

  berdasarkan flouresensi pada pertumbuhan kuman. Tabung gelas berisi media Middlebrook 7H9 yang telah dimodifikasi bersama dengan flouresence quenching

  Mycobacterium tuberculosis . Cara ini

  juga digunakan untuk mendeteksi terhadap pertumbuhan dan uji resistensi terhadap adanya

  Pemeriksaan gold standar untuk TB terdapat 2 jenis pemeriksaan yaitu Pemeriksaan preparat BTA secara langsung dan pemeriksaan kultur padat dan cair, dimana kultur padat yang direkomendasikan oleh WHO adalah menggunakan medium Ogawa dan Low Jensen yang kedua kultur tersebut merupakan kultur padat yang berbasis telur.Tetapi kultur TB tersebut masih memililki kelemahan seperti memerlukan waktu yang cukup lama dan fasilitas metode ini tidak selalu tersedia disetiap laboratorium walaupun memiliki sensitifitas dan spesifisitas yang cukup tinggi. Selain dengan kultur padat, kultur cair MGIT (

  carrier protein (ACP) reductase ini menjadi

  dirasakan belum sesuai dengan yang diharapkan ( Helper, 2010 ). Diperlukan pemeriksaan yang cepat dan mempunyai sensitivitas yang tinggi sehingga dapat mempercepat pengobatan tanpa menunggu konfirmasi hasil kultur yang relatif lama.

  drugs resistance (MDR), tetapi hasilnya masih

  pengawasan langsung menelan obat jangka pendek ), yang telah terbukti menekan penularan, juga mencegah perkembangan multi

  Observed Treatment Short course =

  Resistensi primer adalah keadaan resistensi terhadap Obat AntiTuberculosis (OAT) pada penderita yang belum pernah mendapat pengobatan dengan OAT sebelumnya. Sedangkan resistensi sekunder adalah resistensi yang terjadi pada penderita yang pernah mendapat OAT sebelumnya ( Paul, 1999 ). Upaya penanggulangan penyakit TB sudah dilakukan melalui berbagai program kesehatan di tingkat Puskesmas, berupa pengembangan strategi penanggulangan TB yang dikenal sebagai strategi DOTS ( Directly

  tuberculosis (Nofriyanda, 2010).

  target utama dari obat INH bekerja dalam sintesis asam mikolat pada kuman M.

  tuberculosis .

  Metode Penelitian

  Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif Penelitian ini Hasil Penelitian dilakukan dalam 3 tahapan. Pertama dilakukan

  Penelitian diawali dengan melakukan isolasi DNA dari kultur MGIT, kemudian dilakukan amplifikasi dengan metode PCR dan optimasi kondisi amplifikasi gen inhA dari terakhir dilakukan visualisasi menggunakan kontrol positif. Optimasi dilakukan dengan metode elektroforesis. Isolasi DNA melakukan variasi pengenceran sampel : menggunakan metode boilling water pada suhu

  75%,50%, dan 25%. Didapatkan kondisi 95 º C. Amplifikasi dilakukan menggunakan

  Automated Thermal Cycle dengan siklus

  amplifikasi yang optimum adalah dengan meliputi denaturasi awal 95º C selama 5 menit variasi pengenceran 50%.Hasil optimasi dapat diikuti 40 siklus terdiri dari denaturasi pada 95º dilihat pada gambar 1 dibawah ini :

  C selama 30 detik, annealing pada 50° C selama 30 detik dan ekstensi primer pada 72º C selama 45 detik dan ekstensi akhir pada 72º C selama 5 menit. Elektroforesis menggunakan konsentrasi agarose 1,8%, voltase 50 dalam waktu 60 menit.

  M TP M 50% 500 bp

  300 bp A B

  Gambar 1 . Hasil optimasi variasi pengenceran sampel. A : Kontrol positif yang tanpa pengenceran, B: Kontrol positif dengan variasi pengenceran yang optimum di 50%.

  Berdasarkan hasil optimasi tersebut, maka dilakukan pemeriksaan terhadap 15 sampel isolat DNA. Hasil nya dapat dilihat pada gambar 2 berikut : Keterangan : Well 4 : 161; well 5 :163; well 6 : sampel 167; well 7: sampel 172; well 8 : 190; well 9 : sampel 181; well 10 : sampel 171. Well 11 :173; well 12 :196; well 13 : sampel 183, well 14 : sampel 185; well 15 : sampel 186; well 16 : sampel 200; well 17 : sampel 197; well 18: sampel 212.

  Pembahasan

  Isolasi DNA merupakan pemisahan molekul DNA dari molekul atau komponen lain seperti dinding sel (Shabarni, 2007). Proses isolasi yang digunakan metode isolasi DNA sederhana dengan menggunakan prinsip mekanik / fisika yaitu metode boiling yang memiliki beberapa kelebihan, diantaranya mudah dilakukan, biaya murah, waktu yang dibutuhkan singkat dan lebih ramah lingkungan. Kekurangan dari metode boiling ini adalah kualitas DNA yang dihasilkan relatif lebih rendah dibandingkan dengan metode lain, hal ini terjadi karena proses pengeluaran DNA tidak sempurna sehingga masih dimungkinkan adanya DNA terperangkap dalam sel (Sunarno, dkk, 2014) dan hal tersebut bisa dilihat pada hasil optimasi dan PCR pada penelitian ini. Adanya smear pada hasil PCR menandakan adanya kontaminan pada hasil isolasi DNA. Kualitas DNA diukur berdasarkan kemurniannya pada absorbansi panjang gelombang 260 / 280 dalam kisaran 1,8 - 2,0 (Sambrook,1989). Kemurnian DNA merupakan faktor yang penting karena kontaminasi pada fragmen DNA menyebabkan produk amplifikasi yang tidak diinginkan ikut dilipat gandakan (Fatchiyah, 2011). Produk isolasi DNA yang berkualitas baik ditunjukkan dengan pita DNA yang terlihat tebal dan bersih, DNA yang berkualitas baik ditandai dengan tidak adanya smear pada DNA yang dielektroforesis (Syafaruddin, 2011).

  Dari total 15 sampel yang ada, 5 sampel hasil yang menandakan adanya pita terdapat pada hasil elektroforesis adalah no sampel 181, 183,185,186, dan 200, dengan ukuran produk PCR 207 bp. Ketebalan pita dari hasil sampel yang positif tidak sama , hal ini tergantung pada konsentrasi sampel dari hasil isolasi. Konsentrasi DNA yang diperlukan untuk 500 bp

  M K(-) 4 5 6 7 amplifikasi berkisar antara 100-200 pg/µL (Yuniar, 2003).

• – acyl carrier protein

  Adanya pita yang terbentuk ini menandakan terjadinya resistensi terhadap Isoniazid (INH). Isoniazid (INH) termasuk obat yang bersifat bakterisida dimana

  INH membunuh dengan cepat kuman yang sedang aktif bermultiplikasi. INH aktif bekerja dalam sintesis asam mikolat yang merupakan salah satu komponen pembentukkan dinding sel. Target utama mekanisme ini yaitu mengganggu enzim enoyl

  (ACP) reductase akan menyebabkan terjadinya resistensi terhadap INH (Nofriyanda, 2010).

  Dari hasil PCR yang positif menunjukkan adanya pita dengan ukuran 207 pb adalah pada nomor sampel 181, 183, 185, 186 dan 200. Kemudian dibandingkan dengan hasil DST untuk mengetahui tingkat sensitivitas serta spesifisitas dari PCR yang dilakukan. Berikut tabel hasil perbandingan antara DST dengan teknik PCR seperti yang terlihat pada

• – acyl carrier protein (ACP) reductase melalui adanya ikatan kovalen INH
>– NAD, dengan adanya ikatan ini maka akan menghambat aktivitas enzimatik inhA sehingga menganggu sintesis asam mikolat. Terjadinya mutasi pada gen inhA yang berperan dalam mengkode enzim enoyl tabel 4.1 dibawah ini.Tabel 1.1 Hasil Perbandingan PCR positif dan DST dari kultur cair MGIT

  Dari 15 sampel terdapat 5 sampel positif menggunakan PCR . Dari tabel 1.1 diatas, menunjukkan adanya kesesuaian antara DST serta teknik PCR pada 5 sampel hasil positif. Berdasarkan hasil pemeriksaan tersebut dapat dinyatakan tingkat sensitivitas dan spesifisitas pada metode PCR tersebut sebesar 100%, karena adanya kesesuaian hasil tadi serta mampu mendeteksi sampel dalam jumlah banyak dan waktu singkat serta resiko kontaminasi silang rendah (Dyah, 2013 ). Teknik PCR juga memiliki keunggulan dan kelebihan sehingga sangat menentukan tingkat sensitivitas dan spesifisitas yaitu salah satunya dapat mendeteksi keberadaan kuman walau jumlahnya hanya 1

  No Sampel Hasil PCR Hasil DST 181 Positif Positif 183 Positif Positif 185 Positif Positif 186 Positif Positif 200 Positif Positif

• –10 buah kuman. Prinsip PCR sendiri terdiri atas beberapa siklus dimana pada setiap siklus terjadi penggandaan materi genetik dan jika siklus ini dilakukan berulang- ulang, maka materi genetik yang diperoleh akan
menjadi banyak sehingga mempermudah deteksi keberadaannya (Chandra, 2007).

  Optimasi PCR dilakukan untuk mendapatkan kondisi PCR yang optimal sehingga dihasilkan produk PCR spesifik, yaitu terbentuk pita DNA tebal dengan ukuran sesuai yang diharapkan. Pada penelitian ini digunakan sepasang primer forward dan reverse dengan panjang primer 18 pasang basa, komposisi jumlah Guanin dan Cytosin sebesar 50% hampir sama dengan DNA target yang akan diamplifikasi, hal ini berkaitan dan dapat menentukan kandungan G dan C yang baik untuk primet adalah sekitar 40-60%.

  Konsentrasi MgCl ^{2 yang digunakan pada} optimasi terhadap kontrol positif serta sampel pada penelitian ini yaitu 1,5 mM, konsentrasi yang digunakan tersebut optimum atau ideal karena konsentrasi ion Mg ²⁺ dalam reaksi PCR bisa berkisar antara 0,5 - 5,0 mM. Ion Mg ²⁺ berperan dalam membentuk kompleks dengan dNTP sehingga dNTP menjadi semakin larut, meningkatkan aktivitas enzim DNA

  polymerase . Konsentrasi MgCl ^{2 juga}

  spesifisitas metode PCR dengan adanya primer yang spesifik. Primer yang memiliki ukuran panjang 18-24 pasang basa akan menghasilkan produk PCR spesifik karena akan mempermudah proses penempelan primer dengan cetakanDNA pada saat annealing. Primer dengan panjang kurang dari 18 pasang basa akan menjadikan spesifisitas primer rendah (Darmo, 2001).

  Primer memegang peranan penting untuk spesifisitas maksimal efisiensi PCR. Sensitivitas PCR dipengaruhi oleh persentase kandungan G dan C. Persentase berpengaruh besar terhadap spesifitas dan jumlah produk PCR (Mukhammad Asy

  ’ari, 2005) Konsentrasi DNA yang digunakan pada optimasi terhadap kontrol positif serta sampel pada penelitian ini tidak diketahui karena tidak dilakukan pengukuran konsentrasi DNA terlebih dahulu sebelum dilakukan PCR, akan tetapi pada penelitian ini dilakukan pengenceran dari larutan stok kontrol DNA dan diperoleh pengenceran yang optimal yaitu pada pengenceran 50% karena pada pengenceran tersebut didapatkan pita DNA pada ukuran 207 pb.

  Handoyo Darmo, Rudiretna Ari. (2000 – 2001).

  Prinsip Umum Dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR), 9(1),

  18 – 24. Hewajuli, D.A. (2013). Perkembangan

  Teknologi Reverse Transcriptase

  Kusdarmadji, (2000), Uji Diagnostik

  Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) Pada Penderita Tuberkulosis Paru Tersangka Di Rumah Sakit Umum Pusat Dr. Kariadi Dan BP4 Semarang, Tesis, Semarang, Universitas Diponegoro.

• – Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom Avian Influenza dan Newcastle Diseases, (27).

  Kusuma, Chandra. (2007). Diagnostik

  Tuberkulosis Baru . Sari Pediatri, 8(4), 147. Nofriyanda. (2010). Analisis Molekuler Pada Sambrook, J., Fritsch, E.F, dan Maniatis, T.

  Proses Resistensi Mikobakterium 1989. Molecular Cloning. Cold Spring Tuberkulosis Terhadap Obat Harbor Press. University of Texas South

• – Obat

  Anti Tuberkulosis . Padang: Fakultas Western Medical Centre, Texas.

  Kedokteran Unand Sonia Z., (2014), Amplifikasi DNA Leptospira

  Nur F., (2011), Polimorfisme ikan Kerapu dengan Menggunakan Metode Isulated

  Macan ( Ephinephelus fuscoguttatus) Isothermal Polymerase Chain Reaction yang Tahan Bakteri Vibrio (ii-PCR ), Skripsi, Jakarta, UIN Syarif alginolitycus Dan Toleran Salinitas Hidayatullah.

  Skripsi,

  Rendah Serta Salinitas Tinggi, Makassar, Universitas Hasanudin. Sunarno., Muna Fauzul., Fitri Nyoman. (2014).

  Metode Cepat Ekstraksi DNA

  Nuraida, D. (2010). Pemilihan Bagian Corynebacterium diphtheria Untuk

  Tanaman Kapas Gossypium hirsutum Pemeriksaan PCR , 42(2), 88 – 90. Sebagai Bahan Untuk Isolasi DNA .

  Tuban, 580. Syafaruddin dan T.J. Santoso. 2011. Optimasi

  Metode Isolasi dan Purifikasi DNA yang

  Nurruhwati, Isni. Mulyani, Yuniar., Purwanto, Efisien dan Efektif pada Kemiri Sunan Agus. (2003). Perbandingan Beberapa (Reutalis trisperma (Blanco) Airy Shaw).

  Metode Isolasi DNA Untuk Deteksi J. Littri. 17(1). Dini Koi Herpes virus (KHV) Pada Ikan Mas (Cyprinus carpio. L.) .

  Jatinangor: Fakultas Perikanan dan Syahrini, H. (2008), Tuberkulosis Paru Ilmu Kelautan Universitas Padjajaran. Resisten Ganda, Medan, Universitas Sumatera Utara.

  Onggowidjaja, P., Jasaputra, D.K., Soeng, S.

  (2005). Akurasi Deteksi Mycobacterium Wahyudi, T. Danang. (2006). Sensitivitas dan

  tuberculoisis Dengan Teknik PCR Spesifisitas Pendekatan Sindrom dan Jumlah Sel Polimorfonuklear (PMN) Menggunakan “Primer X” Dibandingkan Dengan Pemeriksaan Pada Infeksi Chlamydia trachomatis Mikroskopik (BTA) Dan Kultur Sputum Genital Wanita Dibandingkan dengan Penderita Dengan Gejala Tuberkulosis Hasil Pemeriksaan Polymerase Chain Paru , 5(1), 7. Reaction (PCR), Makalah, Jakarta, Universitas Indonesia.

  Pranawaty, R.N., Buwono, I.D., Liviawaty, E.

  (2012). Aplikasi Polymerase Chain Wijaya Kusuma, M.I, Murthi, B., Suriyasa, P.

  Reaction (PCR) Konvensional Dan Real (2013). Jurnal Magister Kedokteran Time PCR Untuk Deteksi White Spot Keluarga. Hubungan Pengetahuan, Syndrome Virus Pada Kepiting. Jurnal Sikap, Dan Motivasi Kader Kesehatan Perikanan Dan Kelautan, 3(4), 62. Dengan Aktivitasnya Dalam

  Pengendalian Kasus Tuberkulosis Di Kabupaten Buleleng, 1(1), 38 - 39.