Uji Aktivitas Antioksidan dan Penentuan Kandungan Fenolik Total Pada Pakkat (Calamus caesius Blume.) Chapter III V
BAB III
METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental, karena
penelitian bertujuan untuk mengetahui pengaruh/hubungan antara variabel bebas
dengan variabel terikat. Dalam penelitian ini perlakuan terhadap pakkat
merupakan variabel bebas sedangkan uji aktivitas antioksidan dan penentuan
kandungan fenolik total merupakan variabel terikat. Penelitian ini dilakukan di
Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, pada bulan
Oktober 2016 sampai Desember 2016.
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: alat-alat gelas yang
diperlukan dalam penelitian, blender (Philips), hot plate, kuvet, neraca analitik
(Baeco), pisau (Stainless), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu), stopwatch dan
vortex.
3.1.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bahan yang
berkualitas pro analisis dari E. Merck yaitu DPPH (Sigma), vitamin C, asam galat,
natrium karbonat, Folin-Ciocalteau, metanol dan akuadest.
3.2 Pembuatan Pereaksi
3.2.1 Larutan DPPH 0,5 mM
Sebanyak 9,8 mg DPPH ditimbang kemudian dilarutkan dalam metanol
hingga volume larutan 50 ml (konsentrasi 200 µg/ml) (Molyneux, 2004).
15
Universitas Sumatera Utara
3.2.2 Larutan Natrium Karbonat 20%
Sebanyak 4 g natrium karbonat ditimbang kemudian dilarutkan dalam
akuades hingga diperoleh volume larutan 20 ml.
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara sampling purposif, artinya sampel
dipilih hanya atas dasar pertimbangan peneliti yang menganggap unsur-unsur
yang dikehendaki telah ada dalam anggota sampel yang diambil (Sudjana, 2005).
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotan muda dari hutan
Desa Lumban Pasir Kecamatan Tambangan Kabupaten Mandailing Natal.
Panjang rotan muda yang diambil sekitar 70 cm.
3.3.2 Penyiapan Sampel
3.3.2.1 Pakkat Segar
Rotan muda yang telah dibersihkan, lalu diambil bagian dalam yang
berwarna putih. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan ditiriskan sampai air
cuciannya kering. Selanjutnya ditimbang sebanyak 100 gram dihaluskan dengan
blender. Ditimbang 5 gram pakkat segar untuk digunakan dalam uji aktivitas
antioksidan dan kandungan total fenol.
3.3.2.2 Pakkat Rebus
Rotan muda yang telah dikupas kulit luarnya dan diambil bagian dalam
yang berwarna putih. Kemudian dicuci bersih dengan air mengalir dan ditiriskan
sampai air cucianya kering. Selanjutnya direbus dengan air mendidih pada suhu
100°C dengan perbandingan pakkat yang direbus sebanyak 100 gram dan air yang
digunakan sebanyak 500 ml selama ± 15 menit sampai berwarna putih kecoklatan
16
Universitas Sumatera Utara
dengan sekali perebusan, dinginkan dan dihaluskan dengan blender. Ditimbang
5 gram pakkat segar untuk digunakan dalam uji aktivitas antioksidan dan
kandungan total fenol.
3.3.2.3 Pakkat Bakar
Rotan muda yang kulit luarnya berwarna hijau dibakar menggunakan kayu
bakar selama ±15 menit sampai kulit luarnya berwarna kehitaman, dinginkan,
kemudian dikupas kulit luarnya dan diambil bagian dalamnya. Kemudian dicuci
bersih dengan air mengalir dan ditiriskan sampai air cuciannya kering, selanjutnya
sebanyak 100 gram dihaluskan dengan blender. Ditimbang 5 gram pakkat segar
untuk digunakan dalam uji aktivitas antioksidan dan kandungan total fenol.
3.4 Pengujian Aktivitas Antioksidan Menggunakan Metode Pemerangkapan
Radikal Bebas DPPH
3.4.1 Pembuatan Larutan Blanko
Larutan DPPH 0,5 mM (konsentrasi 200 ppm) dipipet sebanyak 5 ml,
kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, lalu dicukupkan dengan
metanol sampai garis tanda (konsentrasi 40 μg/ml) (Molyneux, 2004).
3.4.2 Pengukuran Panjang Gelombang Serapan Maksimum DPPH
Larutan DPPH konsentrasi 40 µg/ml dihomogenkan dan diukur
serapannya pada panjang gelombang 400-800 nm yang merupakan panjang
gelombang sinar tampak (Gandjar dan Rohman, 2007).
3.4.3 Penentuan Waktu Kerja (Operating Time)
Larutan DPPH konsentrasi 40 ppm dihomogenkan dan diukur absorbansi
larutan pada panjang gelombang 516 nm setiap 1 menit selama 80 menit dan
17
Universitas Sumatera Utara
diamati waktu larutan tersebut mulai menghasilkan absorbansi yang stabil, yang
akan digunakan sebagai operating time.
3.4.4 Pembuatan Larutan Induk
3.4.4.1 Pembuatan Larutan Induk Pakkat
Pakkat segar, pakkat rebus dan pakkat bakar ditimbang 5 gram, masingmasing dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml dilarutkan dengan metanol
lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda (konsentrasi
50000 μg/ml).
3.4.4.2 Pembuatan Larutan Induk Vitamin C
Serbuk vitamin C ditimbang 25 mg, dimasukkan ke dalam labu tentukur
25 ml dilarutkan dengan metanol lalu volumenya dicukupkan dengan metanol
sampai garis tanda (konsentrasi 1000 μg/ml).
3.4.5 Pembuatan Larutan Uji
3.4.5.1 Pembuatan Larutan Uji Pakkat
Konsentrasi ditetapkan setelah dilakukan beberapa orientasi. Larutan
induk dipipet sebanyak 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml dan 2 ml ke dalam labu ukur 25 ml
untuk mendapatkan konsentrasi larutan uji 1000 μg/ml, 2000 μg/ml, 3000 μg/ml,
dan 4000 μg/ml ke dalam masing-masing labu ukur ditambahkan 5 ml larutan
DPPH 0,5 mM (konsentrasi 200 μg/ml) lalu volumenya dicukupkan dengan
metanol sampai garis tanda. Diamkan selama 60 menit, lalu diukur serapannya
menggunakan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang serapan
maksimum yang diperoleh.
18
Universitas Sumatera Utara
3.4.5.2 Pembuatan Larutan Uji Vitamin C
Larutan induk dipipet sebanyak 0,05 ml; 0,1 ml; 0,15 ml dan 0,2 ml
kedalam labu ukur 25 ml untuk mendapatkan konsentrasi larutan uji 2 μg/ml,
4 μg/ml, 6 μg/ml,dan 8 μg/ml, ke dalam masing-masing labu ukur ditambahkan
5 ml larutan DPPH 0,5 mM (konsentrasi 200 μg/ml) lalu volumenya dicukupkan
dengan metanol sampai garis tanda. Diamkan selama 60 menit, lalu diukur
serapannya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang
yang diperoleh.
3.4.6 Analisis Persen Pemerangkapan Radikal Bebas DPPH
Menurut Molyneux (2004), penentuan persen pemerangkapan radikal
bebas oleh sampel pakkat segar, pakkat rebus dan pakkat bakar dengan vitamin C
sebagai kontrol positif, menggunakan metode pemerangkapan radikal bebas 1,1diphenyl-2-picryhydrazil (DPPH), yaitu dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Aktivitas pemerangkapan radikal bebas (%) =
Keterangan:
A kontrol −A sampel
A kontrol
x 100%
Akontrol = Absorbansi tidak mengandung sampel
Asampel = Absorbansi sampel
3.4.7 Analisis Nilai IC50
Perhitungan yang digunakan dalam penentuan aktivitas pemerangkapan
radikal bebas adalah nilai IC50 (Inhibitory Concentration), nilai tersebut
menggambarkan besarnya konsentrasi senyawa uji yang dapat memerangkap
radikal bebas sebesar 50%. Hasil perhitungan dimasukkan ke dalam persamaan
regresi dengan konsentrasi sampel (μg/ml) sebagai absis (sumbu x) dan nilai %
inhibisi sebagai ordinatnya (sumbu y) (Mardawati, dkk., 2008).
19
Universitas Sumatera Utara
3.5 Penentuan Kandungan Fenolik Total
3.5.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Asam Galat
Sebanyak 10 mg serbuk asam galat, dimasukkan ke dalam labu tentukur
10 ml dilarutkan dengan metanol lalu volumenya dicukupkan dengan metanol
sampai garis tanda (konsentrasi 1000 μg/ml)..
3.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Asam Galat
Dipipet larutan asam galat konsentrasi 1000 μg/ml sebanyak 0,5 ml dan
dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml. Ditambahkan 7,5 ml akuades dan
0,5 ml larutan Folin-Ciocalteu, kemudian dihomogenkan dengan alat vortex
selama 1 menit lalu didiamkan, selanjutnya ditambahkan 1,5 ml larutan natrium
karbonat
20%.
Ukur panjang gelombang maksimum menggunakan
spektrofotometer UV-Visibel pada rentang 400 nm ̶ 800 nm.
3.5.3 Penentuan Waktu Kerja (Operating Time)
Dipipet larutan asam galat konsentrasi 1000 μg/ml sebanyak 0,5 ml dan
dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml. Ditambahkan 7,5 ml akuades dan
0,5 ml larutan Folin-Ciocalteu, kemudian dihomogenkan dengan alat vortex
selama 1 menit lalu didiamkan, selanjutnya ditambahkan 1,5 ml larutan natrium
karbonat 20%. Diukur absorbansi larutan pada panjang gelombang 775 nm setiap
1 menit dan diamati waktu larutan tersebut mulai menghasilkan absorbansi yang
stabil, yang akan digunakan sebagai operating time.
3.5.4 Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Galat
Dipipet larutan asam galat konsentrasi 1000 μg/ml sebanyak 0,1 ml;
0,2 ml; 0,3 ml; 0,4 ml dan 0,5 ml, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur
10 ml dan ditambahkan dengan metanol sampai garis tanda (konsentrasi 10 μg/ml,
20
Universitas Sumatera Utara
20 μg/ml, 30 μg/ml, 40 μg/ml dan 50 μg/ml). Sebanyak
0,5 ml dari setiap
kosentrasi larutan dalam labu tentukur 10 ml ditambahkan 7,5 ml akuades dan
0,5 ml larutan Folin-Ciocalteu, kemudian dihomogenkan dengan alat vortex
selama 1 menit lalu didiamkan, selanjutnya ditambahkan 1,5 ml larutan natrium
karbonat 20% dan didiamkan selama 90 menit, diukur absorbansinya pada
panjang gelombang maksimum dan didapat kurva kalibrasi asam galat serta
persamaan garis linear y = ax + b.
3.5.5 Pembuatan Larutan Uji Pakkat
Ditimbang 50 mg pakkat segar, pakkat rebus dan pakat bakkar masingmasing dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan metanol lalu
volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda (konsentrasi
1000 μg/ml). Selanjutnya dipipet 0,5 ml larutan dan ditambahkan 7,5 ml akuades
dan 0,5 ml larutan Folin-Ciocalteu, kemudian dihomogenkan dengan alat vortex
selama 1 menit lalu didiamkan, selanjutnya ditambahkan 1,5 ml larutan natrium
karbonat 20% dan didiamkan selama 90 menit dan diukur absorbansinya pada
panjang gelombang 775 nm. Konsentrasi fenol dalam larutan uji dihitung dari plot
kalibrasi dan dinyatakan sebagai mg asam galat setara dengan mg/g dari sampel.
21
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan menunjukkan bahwa tumbuhan yang diuji
adalah pakkat (Calamus caesius Blume.) famili Arecaceae, yang dilakukan oleh
Herbarium Medanense Universitas Sumatera Utara, Medan. Hasil identifikasi
dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 36.
4.2 Hasil Analisis Aktivitas Antioksidan Pakkat Metode DPPH
Hasil uji aktivitas antioksidan Pakkat dengan metode pemerangkapan
1,1-diphenyl-2-picrylhidrazyl (DPPH) secara spektrofotometri UV-Vis dilakukan
pengukuran pada panjang gelombang 516 nm. Larutan DPPH dalam metanol
menghasilkan serapan maksimum pada panjang gelombang 516 nm, termasuk
dalam kisaran panjang gelombang sinar tampak (400-800 nm) (Gandjar dan
Rohman, 2007).
4.2.1 Hasil Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum
Pengukuran serapan maksimum larutan DPPH dengan konsentrasi
40 µg/ml
dalam metanol menggunakan spektrofotometri UV-Visibel. Kurva
serapan panjang gelombang maksimum dapat dilihat pada Gambar 4.1.
Hasil pengukuran menunjukkan bahwa larutan DPPH 40 μg/ml dalam
metanol menghasilkan serapan maksimum pada panjang gelombang 516 nm.
Panjang gelombang 516 nm, termasuk dalam kisaran panjang gelombang sinar
22
Universitas Sumatera Utara
tampak 400-800 nm, serta termasuk dalam rentang panjang gelombang DPPH
yang berkisar antara 515-520 nm (Gandjar dan Rohman, 2007; Molyneux, 2004).
Gambar 4.1 Kurva serapan larutan DPPH (40 μg/ml) dalam metanol
4.2.2 Hasil Penentuan Waktu Kerja (Operating Time)
Waktu kerja bertujuan untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil.
Ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan
absorbansi larutan (Gandjar dan Rohman, 2007). Hasil analisis pengukuran waktu
kerja (operating time) dengan menggunakan larutan DPPH 0,5 mM dalam
metanol dengan konsentrasi 40 μg/ml diukur selama 80 menit, sudah
menunjukkan kestabilan pada menit ke 59 sampai dengan menit ke 62. Lama
pengukuran metode DPPH menurut beberapa literatur yang direkomendasikan
adalah selama 60 menit, tetapi dalam beberapa penelitian waktu yang digunakan
sangat bervariasi dari 1 menit hingga 240 menit (Marinova dan Batchvarov,
2011).
4.2.3 Hasil Analisis Aktivitas Antioksidan Pakkat
Aktivitas antioksidan pakkat segar, pakkat rebus dan pakkat bakar.
diperoleh hasil pengukuran absorbansi DPPH pada menit ke-60 dengan adanya
23
Universitas Sumatera Utara
penambahan larutan uji dengan konsentrasi 1000 μg/ml; 2000 μg/ml;
3000 μg/ml dan 4000 μg/ml yang dibandingkan dengan kontrol DPPH tanpa
larutan uji. Persen pemerangkapan DPPH oleh pakkat segar, pakkat rebus dan
pakkat bakar serta persen pemerangkapan DPPH oleh vitamin C dapat dilihat
pada Tabel 4.1 dan 4.2.
Tabel 4.1 Persen Pemerangkapan DPPH oleh Pakkat Segar, Pakkat Rebus dan
Pakkat Bakar.
% Pemerangkapan
Larutan Konsentrasi
RataUji
(µg/ml)
I
II
III
IV
V
VI
Rata
0
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1000
22,46 22,35 22,37 22,29 22,53 22,61 22,45
Pakkat
2000
39,39 39,24 39,23 39,12 39,05 39,46 39,24
Segar
3000
54,62 55,24 56,89 56,78 57,21 57,43 56,36
4000
71,74 72,03 72,15 72,23 72,10 72,34 72,09
0
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1000
15,71 15,76 15,64 15,75 15,64 15,73 15,71
Pakkat
2000
22,70 22,71 22,61 22,73 22,65 22,69 22,68
Rebus
3000
38,81 38,83 38,74 38,82 38,79 38,83 38,80
4000
53,32 53,34 53,12 53,39 53,36 53,37 53,31
0
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1000
56,36 56,38 56,37 56,37 56,39 56,39 56,37
Pakkat
2000
70,68 70,67 70,68 70,69 70,65 70,62 70,66
Bakar
3000
81,70 81,81 81,72 81,73 81,78 80,51 81,54
4000
96,16 95,85 95,92 95,94 95,92 96,01 95,90
Keterangan: Rata-rata %pemerangkapan 6 kali pengulangan
Tabel 4.2 Persen Pemerangkapan DPPH oleh Vitamin C
Keterangan: Rata-rata %pemerangkapan 6 kali pengulangan
Tabel 4.1 dan 4.2 dapat dilihat bahwa adanya kenaikan persen
pemerangkapan pada DPPH yang diberi pakkat segar, pakkat rebus dan pakkat
24
Universitas Sumatera Utara
bakar serta vitamin C sebagai pembanding dalam metanol pada setiap kenaikan
konsentrasi. Persen pemerangkapan terjadi karena adanya senyawa yang bereaksi
sebagai penangkap radikal yang akan mereduksi DPPH membentuk DPPH-H
yang tereduksi. Reaksi ini diamati dengan adanya perubahan warna DPPH dari
ungu menjadi kuning ketika elektron ganjil dari radikal DPPH telah berpasangan
dengan hidrogen dari senyawa penangkap radikal bebas. Keberadaan antioksidan
dalam tumbuhan akan menetralisasi radikal DPPH dengan memberikan elektron
kepada DPPH, menghasilkan perubahan warna dari ungu menjadi kuning atau
intensitas warna ungu larutan jadi berkurang (Molyneux, 2004). Penghilangan
warna akan sebanding dengan jumlah elektron yang diambil oleh DPPH sehingga
dapat diukur secara spektrofotometri (Garcia, dkk., 2012)
4.2.4 Hasil Analisis Nilai IC50 (Inhibitory Concentration)
Nilai IC50 diperoleh berdasarkan perhitungan persamaan regresi dengan
cara memplot konsentrasi larutan uji dan % peredaman DPPH sebagai parameter
aktivitas antioksidan, konsentrasi sampel (μg/ml) sebagai absis (sumbu X) dan
nilai % inhibisi sebagai ordinat (sumbu Y). Hasil persamaan regresi linier dan
hasil analisis nilai IC50 yang diperoleh dari pakkat segar, pakkat rebus, pakkat
bakar, dan vitamin C dapat dilihat pada Tabel 4.3 dan kategori nilai IC50 sebagai
antioksidan dapat dilihat pada Tabel 4.4.
Tabel 4.3 Hasil Persamaan Regresi Linier dan Hasil Analisis IC50 dari Pakkat
Segar, Pakkat Rebus, Pakkat Bakar, dan Vitamin C
Larutan Uji
Persamaan Regresi
IC50 (μg/ml)
Pakkat Segar
Y= 0,017809x + 2,410
2672,24
Pakkat Rebus
Y= 0,012972x + 2,393
3841,76
Pakkat Bakar
Y= 0,021698x + 17,501
1497,74
Vitamin C
Y= 10,5967 x – 0,975
4,81
25
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.4 Kategori Nilai IC50 sebagai Antioksidan
No.
Kategori
1.
Sangat Kuat
2.
Kuat
3.
Sedang
4.
Lemah
Sumber: Winarsi (2014)
Konsentrasi (µg/ml )
< 50
50-100
101-150
>151
Hasil dari Tabel 4.3 dan 4.4 diatas diketahui bahwa pakkat segar, pakkat
rebus, dan pakkat bakar menunjukkan aktivitas antioksidan kategori sangat lemah
dengan nilai IC50 berturut-turut sebesar 2672,24 μg/ml; 3841,76 μg/ml; dan
1497,74 μg/ml. Dibandingkan dengan vitamin C sebagai kontrol positif yang
termasuk dalam kategori sangat kuat dengan nilai IC50 4,81 μg/ml. Berdasarkan
data yang didapat diketahui bahwa terjadinya penurunan aktivitas antioksidan
pada pakkat rebus dibandingkan dengan pakkat segar dan hal berbeda terjadi pada
pakkat bakar mengalami peningkatan aktivitas antioksidan dibandingkan pakkat
segar.
Penurunan aktivitas antioksidan pada pakkat rebus dibandingkan pakkat
segar kemungkinan terjadi senyawa kimia yang berpotensi sebagai antioksidan
terlarut didalam air perebusan. Hal ini seesuai dengan penelitian yang sebelumnya
menyatakan bahwa proses perebusan mengakibatkan dinding sel dan membran
plasma cepat mengalami kerusakan. Air masuk kedalam dinding sel dan vakuola
kemudian melarutkan senyawa kimia yang berpotensi sebagai antioksidan
kedalam cairan pengolahan (Syaifuddin, 2015).
Peningkatan aktivitas antioksidan pada pakkat bakar dibandingkan pakkat
segar mengalami degradasi kimia dan fisik ketika dilakukan proses pemanasan.
Menurut (Santoso, 2016) senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan seperti
senyawa flavonoid dan senyawa fenolik-fenolik lainnya umumnya ada dalam
26
Universitas Sumatera Utara
bentuk terikat dengan jenis-jenis gula tertentu. Selama proses pemanasan ikatan
gikosidik pecah sehingga dihasilkan bentuk glikon flavonoid. glikon ini
aktivitasnya antioksidannya lebih tinggi daripada yang dalam bentuk terikat
dengan gula.
Penetapan kadar air pada pakkat segar, rebus dan bakar yang telah
dilakukan oleh Lubis (2015), diperoleh masing-masing sebesar 88,68%, 90,66%,
dan 88,25% serta persen rendemen bahan basah menjadi bahan kering masingmasing perlakuan sebesar 11,35%, 11,74%, dan 9,33%. Pakkat segar, pakkat
rebus dan pakkat bakar sejumlah 5 gram akan menghasilkan bahan kering masingmasing 0,567 g, 0,587 g, dan 0,466 g, sehingga nilai IC50 yang dihasilkan dari
bahan kering akan lebih kuat jika dibandingkan bahan basah (segar) dengan
perlakuan yang sama.
Penelitian yang telah dilakukan Aisyah dkk., (2015), aktivitas antioksidan
bahkan menjadi lebih kuat setelah perlakuan panas. Hal yang sama juga telah
dilakukan Turkmen dkk., (2005), menyatakan bahwa kacang polong dan brokoli
setelah dimasak mempunyai jumlah aktivitas antioksidan lebih kuat atau tidak
berubah (tetap) bergantung pada cara pengolahannya.
4.3 Hasil Analisis Kandungan Fenoik Total
4.3.1 Hasil Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Asam Galat
Pengukuran serapan maksimum asam galat dengan penambahan reagen
Folin-Ciocalteu, natrium karbonat 20% serta akuades pada konsentrasi
1000 μg/ml menggunakan spektrofotometri visibel. Kurva serapan panjang
gelombang maksimum dapat dilihat pada Gambar 4.2
27
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.2 Kurva serapan larutan asam galat (1000 μg/ml) secara
spektrofotometri visibel.
4.3.2 Hasil Penentuan Waktu Kerja (Operating Time)
Waktu kerja (operating time) bertujuan untuk mengetahui waktu
pengukuran yang stabil. Waktu kerja ditentukan dengan mengukur hubungan
antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan (Gandjar dan Rohman, 2007)
Lama pengukuran metode Folin-Ciocalteu dilakukan setelah masing-masing
sampel yang telah ditambahkan reagen lalu didiamkan selama 90 menit masa
inkubasinya pada suhu ruangan (Sayuti dan Yenrina, 2015).
Penetapan kandungan fenolik total dimulai dengan melakukan waktu kerja
larutan baku asam galat konsentrasi 1000 µg/ml segera setelah penambahan
reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 20% pada panjang
gelombang 775 nm. Larutan tersebut mulai menghasilkan nilai absorbansi yang
stabil pada menit ke-90, dengan demikian dipilih waktu pendiaman selama 90
menit sejak pencampuran sampel.
28
Universitas Sumatera Utara
4.3.3 Hasil Penentuan Kurva Kalibrasi Asam Galat
Penentuan Kurva kalibrasi asam galat dibuat dengan mengukur absorbansi
larutan asam galat dengan konsentrasi 10 μg/ml, 20 μg/ml, 30 μg/ml, 40 μg/ml,
dan 50 μg/ml dengan penambahan Folin-Ciocalteu, natrium karbonat 20% serta
akuades pada panjang gelombang 775 nm. Nilai absorbansi standar asam galat
dapat diihat pada Tabel 4.5.
Tabel 4.5 Nilai Absorbansi Standar Asam Galat
Sampel
Konsentrasi (µg/ml)
(x)
Absorbansi
(y)
0
0,00009
10
0,06180
20
0,13573
30
0,20044
40
0,26804
50
0,33528
Asam Galat
Persamaan Regresi
Y = 0,00674X 0,0016
Berdasarkan tabel tersebut diperoleh kurva kalibrasi larutan asam galat seperti
ditunjukkan pada Gambar 4.3 berikut:
0,4
Absorbansi
0,3
0,2
y = 0.00674x - 0.0016
r = 0.9997
0,1
0
-0,1
0
10
20
30
40
50
60
Konsentrasi (µg/ml)
Gambar 4.3 Kurva Kalibrasi Larutan Standar Asam Galat
Kurva kalibrasi didapat dari hubungan berbagai kadar asam galat dengan
absorbansi yang terbentuk. Berdasarkan kurva kalibrasi ini diperoleh nilai
koefisien korelasi (r). Nilai koefisien korelasi berkisaran antara 0 sampai 1 yang
menunjukkan seberapa dekat nilai perkiraan untuk analisis regresi yang mewakili
29
Universitas Sumatera Utara
data yang sebenarnya. Berdasarkan kurva kalibrasi diatas diperoleh persamaan
garis regresi y = 0.00674x - 0.0016 dengan nilai Koefisien korelasi = 0,9997.
4.3.4 Hasil Penentuan Kandungan Fenolik Total pada Pakkat
Kandungan fenolik total dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Untuk
menentukan kandungan fenolik total digunakan asam galat sebagai standar. Nilai
absorbansi dari pakkat segar, pakkat rebus dan pakkat bakar diplotkan terhadap
kurva standar asam galat dan dihitung senyawa fenoliknya. Hasil Kandungan
fenolik total dari pakkat segar, pakkat rebus dan pakkat bakar dapat dilihat pada
Tabel 4.6.
Tabel 4.6 Hasil kandungan fenolik total dari pakkat segar, pakkat rebus dan
pakkat bakar
Volume
Kadar
Rata-Rata Kadar
Larutan
Larutan Sampel Absorbansi Total Fenol
Fenolik Total
Uji
(ml)
(mg/g)
(mg GAE/g)
0,0995
2,2964
0,0995
2,9661
0,0996
2,9673
Pakkat
10
2,9674
Segar
0,0998
2,9723
0,0996
2,9673
0,0996
2,9673
0,0585
1,7777
0,0582
1,7642
0,0587
1,7798
Pakkat
10
1,7780
Rebus
0,0590
1,7886
0,0589
1,7848
0,0585
1,7730
0,1997
5,9629
0,1999
5,9685
0,2001
5,9732
Pakkat
10
5,9856
Bakar
0,2005
5,9866
0,2010
6,0019
0,2016
6,0188
Keterangan: Kandungan fenolik total yang diperoleh adalah kadar rata-rata total
fenol 6 kali pengulangan
30
Universitas Sumatera Utara
Berdasarkan Tabel 4.6 dapat dillihat kadar kandungan fenolik total dari
pakkat
segar,
pakkat
rebus
dan
pakkat
bakar
berturut-turut
sebesar
2,9674 mg GAE/g; 1,7780 mg GAE/g; dan 5,9856 mg GAE/g. Berdasarkan data
yang didapat diketahui bahwa terjadi penurunan kadar fenolik total pada pakkat
rebus sebesar 40,07%
dibandingkan dengan pakkat segar. Penurunan kadar
kandungan fenolik total setelah perebusan diduga karena larutnya fenol dalam air.
Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air karena umumnya mereka sering
kali berikatan dengan gula sebagai glikosida, dan biasanya terdapat dalam vakuola
sel (Harbone, 1987).
Sebaliknya, hal berbeda terjadi pada pakkat bakar mengalami peningkatan
kadar fenolik total sebesar 101,75% dibandingkan pakkat segar. Hal ini karena
pengolahan dengan cara pembakaran menyebabkan kandungan air yang terdapat
didalam sampel akan menguap sehingga senyawa fenol yang didapat lebih tinggi.
Selain itu setiap tanaman memiliki berbagai jenis senyawa fenolik yang berbedabeda menyebabkan terjadinya pembelahan fenolik yang mempunyi kandungan
fenolik yang lebih tinggi atau lebih rendah sesuai dengan jenis tanaman dan panas
yang diterapkan (Ramdhan dan Aminah, 2014) .
31
Universitas Sumatera Utara
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
a. Hasil perhitungan nilai IC50 dari pakkat segar, rebus, dan bakar diperoleh
dengan nilai IC50 masing-masing sebesar 2672,24 μg/ml; 3841,76 μg/ml; dan
1497,74 μg/ml menunjukkan kekuatan antioksidan dalam kategori sangat
lemah.
b. Kadar fenolik total pada pakkat yang segar, rebus dan bakar masing-masing
sebesar 2,9674 mg GAE/g; 1,7780 mg GAE/g; dan 5,9856 mg GAE/g dengan
metode Folin-Ciocalteu.
5.2 Saran
a. Disarankan kepada masyarakat untuk mengkonsumsi pakkat bakar karena
aktivitas antioksidan lebih tinggi dibandingkan dengan pakkat segar dan
pakkat rebus.
b. Disarankan kepada peneliti selanjutnya untuk melakukan ekstraksi dengan
pelarut polar.
32
Universitas Sumatera Utara
METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental, karena
penelitian bertujuan untuk mengetahui pengaruh/hubungan antara variabel bebas
dengan variabel terikat. Dalam penelitian ini perlakuan terhadap pakkat
merupakan variabel bebas sedangkan uji aktivitas antioksidan dan penentuan
kandungan fenolik total merupakan variabel terikat. Penelitian ini dilakukan di
Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, pada bulan
Oktober 2016 sampai Desember 2016.
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: alat-alat gelas yang
diperlukan dalam penelitian, blender (Philips), hot plate, kuvet, neraca analitik
(Baeco), pisau (Stainless), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu), stopwatch dan
vortex.
3.1.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bahan yang
berkualitas pro analisis dari E. Merck yaitu DPPH (Sigma), vitamin C, asam galat,
natrium karbonat, Folin-Ciocalteau, metanol dan akuadest.
3.2 Pembuatan Pereaksi
3.2.1 Larutan DPPH 0,5 mM
Sebanyak 9,8 mg DPPH ditimbang kemudian dilarutkan dalam metanol
hingga volume larutan 50 ml (konsentrasi 200 µg/ml) (Molyneux, 2004).
15
Universitas Sumatera Utara
3.2.2 Larutan Natrium Karbonat 20%
Sebanyak 4 g natrium karbonat ditimbang kemudian dilarutkan dalam
akuades hingga diperoleh volume larutan 20 ml.
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara sampling purposif, artinya sampel
dipilih hanya atas dasar pertimbangan peneliti yang menganggap unsur-unsur
yang dikehendaki telah ada dalam anggota sampel yang diambil (Sudjana, 2005).
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotan muda dari hutan
Desa Lumban Pasir Kecamatan Tambangan Kabupaten Mandailing Natal.
Panjang rotan muda yang diambil sekitar 70 cm.
3.3.2 Penyiapan Sampel
3.3.2.1 Pakkat Segar
Rotan muda yang telah dibersihkan, lalu diambil bagian dalam yang
berwarna putih. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan ditiriskan sampai air
cuciannya kering. Selanjutnya ditimbang sebanyak 100 gram dihaluskan dengan
blender. Ditimbang 5 gram pakkat segar untuk digunakan dalam uji aktivitas
antioksidan dan kandungan total fenol.
3.3.2.2 Pakkat Rebus
Rotan muda yang telah dikupas kulit luarnya dan diambil bagian dalam
yang berwarna putih. Kemudian dicuci bersih dengan air mengalir dan ditiriskan
sampai air cucianya kering. Selanjutnya direbus dengan air mendidih pada suhu
100°C dengan perbandingan pakkat yang direbus sebanyak 100 gram dan air yang
digunakan sebanyak 500 ml selama ± 15 menit sampai berwarna putih kecoklatan
16
Universitas Sumatera Utara
dengan sekali perebusan, dinginkan dan dihaluskan dengan blender. Ditimbang
5 gram pakkat segar untuk digunakan dalam uji aktivitas antioksidan dan
kandungan total fenol.
3.3.2.3 Pakkat Bakar
Rotan muda yang kulit luarnya berwarna hijau dibakar menggunakan kayu
bakar selama ±15 menit sampai kulit luarnya berwarna kehitaman, dinginkan,
kemudian dikupas kulit luarnya dan diambil bagian dalamnya. Kemudian dicuci
bersih dengan air mengalir dan ditiriskan sampai air cuciannya kering, selanjutnya
sebanyak 100 gram dihaluskan dengan blender. Ditimbang 5 gram pakkat segar
untuk digunakan dalam uji aktivitas antioksidan dan kandungan total fenol.
3.4 Pengujian Aktivitas Antioksidan Menggunakan Metode Pemerangkapan
Radikal Bebas DPPH
3.4.1 Pembuatan Larutan Blanko
Larutan DPPH 0,5 mM (konsentrasi 200 ppm) dipipet sebanyak 5 ml,
kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, lalu dicukupkan dengan
metanol sampai garis tanda (konsentrasi 40 μg/ml) (Molyneux, 2004).
3.4.2 Pengukuran Panjang Gelombang Serapan Maksimum DPPH
Larutan DPPH konsentrasi 40 µg/ml dihomogenkan dan diukur
serapannya pada panjang gelombang 400-800 nm yang merupakan panjang
gelombang sinar tampak (Gandjar dan Rohman, 2007).
3.4.3 Penentuan Waktu Kerja (Operating Time)
Larutan DPPH konsentrasi 40 ppm dihomogenkan dan diukur absorbansi
larutan pada panjang gelombang 516 nm setiap 1 menit selama 80 menit dan
17
Universitas Sumatera Utara
diamati waktu larutan tersebut mulai menghasilkan absorbansi yang stabil, yang
akan digunakan sebagai operating time.
3.4.4 Pembuatan Larutan Induk
3.4.4.1 Pembuatan Larutan Induk Pakkat
Pakkat segar, pakkat rebus dan pakkat bakar ditimbang 5 gram, masingmasing dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml dilarutkan dengan metanol
lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda (konsentrasi
50000 μg/ml).
3.4.4.2 Pembuatan Larutan Induk Vitamin C
Serbuk vitamin C ditimbang 25 mg, dimasukkan ke dalam labu tentukur
25 ml dilarutkan dengan metanol lalu volumenya dicukupkan dengan metanol
sampai garis tanda (konsentrasi 1000 μg/ml).
3.4.5 Pembuatan Larutan Uji
3.4.5.1 Pembuatan Larutan Uji Pakkat
Konsentrasi ditetapkan setelah dilakukan beberapa orientasi. Larutan
induk dipipet sebanyak 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml dan 2 ml ke dalam labu ukur 25 ml
untuk mendapatkan konsentrasi larutan uji 1000 μg/ml, 2000 μg/ml, 3000 μg/ml,
dan 4000 μg/ml ke dalam masing-masing labu ukur ditambahkan 5 ml larutan
DPPH 0,5 mM (konsentrasi 200 μg/ml) lalu volumenya dicukupkan dengan
metanol sampai garis tanda. Diamkan selama 60 menit, lalu diukur serapannya
menggunakan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang serapan
maksimum yang diperoleh.
18
Universitas Sumatera Utara
3.4.5.2 Pembuatan Larutan Uji Vitamin C
Larutan induk dipipet sebanyak 0,05 ml; 0,1 ml; 0,15 ml dan 0,2 ml
kedalam labu ukur 25 ml untuk mendapatkan konsentrasi larutan uji 2 μg/ml,
4 μg/ml, 6 μg/ml,dan 8 μg/ml, ke dalam masing-masing labu ukur ditambahkan
5 ml larutan DPPH 0,5 mM (konsentrasi 200 μg/ml) lalu volumenya dicukupkan
dengan metanol sampai garis tanda. Diamkan selama 60 menit, lalu diukur
serapannya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang
yang diperoleh.
3.4.6 Analisis Persen Pemerangkapan Radikal Bebas DPPH
Menurut Molyneux (2004), penentuan persen pemerangkapan radikal
bebas oleh sampel pakkat segar, pakkat rebus dan pakkat bakar dengan vitamin C
sebagai kontrol positif, menggunakan metode pemerangkapan radikal bebas 1,1diphenyl-2-picryhydrazil (DPPH), yaitu dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Aktivitas pemerangkapan radikal bebas (%) =
Keterangan:
A kontrol −A sampel
A kontrol
x 100%
Akontrol = Absorbansi tidak mengandung sampel
Asampel = Absorbansi sampel
3.4.7 Analisis Nilai IC50
Perhitungan yang digunakan dalam penentuan aktivitas pemerangkapan
radikal bebas adalah nilai IC50 (Inhibitory Concentration), nilai tersebut
menggambarkan besarnya konsentrasi senyawa uji yang dapat memerangkap
radikal bebas sebesar 50%. Hasil perhitungan dimasukkan ke dalam persamaan
regresi dengan konsentrasi sampel (μg/ml) sebagai absis (sumbu x) dan nilai %
inhibisi sebagai ordinatnya (sumbu y) (Mardawati, dkk., 2008).
19
Universitas Sumatera Utara
3.5 Penentuan Kandungan Fenolik Total
3.5.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Asam Galat
Sebanyak 10 mg serbuk asam galat, dimasukkan ke dalam labu tentukur
10 ml dilarutkan dengan metanol lalu volumenya dicukupkan dengan metanol
sampai garis tanda (konsentrasi 1000 μg/ml)..
3.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Asam Galat
Dipipet larutan asam galat konsentrasi 1000 μg/ml sebanyak 0,5 ml dan
dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml. Ditambahkan 7,5 ml akuades dan
0,5 ml larutan Folin-Ciocalteu, kemudian dihomogenkan dengan alat vortex
selama 1 menit lalu didiamkan, selanjutnya ditambahkan 1,5 ml larutan natrium
karbonat
20%.
Ukur panjang gelombang maksimum menggunakan
spektrofotometer UV-Visibel pada rentang 400 nm ̶ 800 nm.
3.5.3 Penentuan Waktu Kerja (Operating Time)
Dipipet larutan asam galat konsentrasi 1000 μg/ml sebanyak 0,5 ml dan
dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml. Ditambahkan 7,5 ml akuades dan
0,5 ml larutan Folin-Ciocalteu, kemudian dihomogenkan dengan alat vortex
selama 1 menit lalu didiamkan, selanjutnya ditambahkan 1,5 ml larutan natrium
karbonat 20%. Diukur absorbansi larutan pada panjang gelombang 775 nm setiap
1 menit dan diamati waktu larutan tersebut mulai menghasilkan absorbansi yang
stabil, yang akan digunakan sebagai operating time.
3.5.4 Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Galat
Dipipet larutan asam galat konsentrasi 1000 μg/ml sebanyak 0,1 ml;
0,2 ml; 0,3 ml; 0,4 ml dan 0,5 ml, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur
10 ml dan ditambahkan dengan metanol sampai garis tanda (konsentrasi 10 μg/ml,
20
Universitas Sumatera Utara
20 μg/ml, 30 μg/ml, 40 μg/ml dan 50 μg/ml). Sebanyak
0,5 ml dari setiap
kosentrasi larutan dalam labu tentukur 10 ml ditambahkan 7,5 ml akuades dan
0,5 ml larutan Folin-Ciocalteu, kemudian dihomogenkan dengan alat vortex
selama 1 menit lalu didiamkan, selanjutnya ditambahkan 1,5 ml larutan natrium
karbonat 20% dan didiamkan selama 90 menit, diukur absorbansinya pada
panjang gelombang maksimum dan didapat kurva kalibrasi asam galat serta
persamaan garis linear y = ax + b.
3.5.5 Pembuatan Larutan Uji Pakkat
Ditimbang 50 mg pakkat segar, pakkat rebus dan pakat bakkar masingmasing dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan metanol lalu
volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda (konsentrasi
1000 μg/ml). Selanjutnya dipipet 0,5 ml larutan dan ditambahkan 7,5 ml akuades
dan 0,5 ml larutan Folin-Ciocalteu, kemudian dihomogenkan dengan alat vortex
selama 1 menit lalu didiamkan, selanjutnya ditambahkan 1,5 ml larutan natrium
karbonat 20% dan didiamkan selama 90 menit dan diukur absorbansinya pada
panjang gelombang 775 nm. Konsentrasi fenol dalam larutan uji dihitung dari plot
kalibrasi dan dinyatakan sebagai mg asam galat setara dengan mg/g dari sampel.
21
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan menunjukkan bahwa tumbuhan yang diuji
adalah pakkat (Calamus caesius Blume.) famili Arecaceae, yang dilakukan oleh
Herbarium Medanense Universitas Sumatera Utara, Medan. Hasil identifikasi
dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 36.
4.2 Hasil Analisis Aktivitas Antioksidan Pakkat Metode DPPH
Hasil uji aktivitas antioksidan Pakkat dengan metode pemerangkapan
1,1-diphenyl-2-picrylhidrazyl (DPPH) secara spektrofotometri UV-Vis dilakukan
pengukuran pada panjang gelombang 516 nm. Larutan DPPH dalam metanol
menghasilkan serapan maksimum pada panjang gelombang 516 nm, termasuk
dalam kisaran panjang gelombang sinar tampak (400-800 nm) (Gandjar dan
Rohman, 2007).
4.2.1 Hasil Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum
Pengukuran serapan maksimum larutan DPPH dengan konsentrasi
40 µg/ml
dalam metanol menggunakan spektrofotometri UV-Visibel. Kurva
serapan panjang gelombang maksimum dapat dilihat pada Gambar 4.1.
Hasil pengukuran menunjukkan bahwa larutan DPPH 40 μg/ml dalam
metanol menghasilkan serapan maksimum pada panjang gelombang 516 nm.
Panjang gelombang 516 nm, termasuk dalam kisaran panjang gelombang sinar
22
Universitas Sumatera Utara
tampak 400-800 nm, serta termasuk dalam rentang panjang gelombang DPPH
yang berkisar antara 515-520 nm (Gandjar dan Rohman, 2007; Molyneux, 2004).
Gambar 4.1 Kurva serapan larutan DPPH (40 μg/ml) dalam metanol
4.2.2 Hasil Penentuan Waktu Kerja (Operating Time)
Waktu kerja bertujuan untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil.
Ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan
absorbansi larutan (Gandjar dan Rohman, 2007). Hasil analisis pengukuran waktu
kerja (operating time) dengan menggunakan larutan DPPH 0,5 mM dalam
metanol dengan konsentrasi 40 μg/ml diukur selama 80 menit, sudah
menunjukkan kestabilan pada menit ke 59 sampai dengan menit ke 62. Lama
pengukuran metode DPPH menurut beberapa literatur yang direkomendasikan
adalah selama 60 menit, tetapi dalam beberapa penelitian waktu yang digunakan
sangat bervariasi dari 1 menit hingga 240 menit (Marinova dan Batchvarov,
2011).
4.2.3 Hasil Analisis Aktivitas Antioksidan Pakkat
Aktivitas antioksidan pakkat segar, pakkat rebus dan pakkat bakar.
diperoleh hasil pengukuran absorbansi DPPH pada menit ke-60 dengan adanya
23
Universitas Sumatera Utara
penambahan larutan uji dengan konsentrasi 1000 μg/ml; 2000 μg/ml;
3000 μg/ml dan 4000 μg/ml yang dibandingkan dengan kontrol DPPH tanpa
larutan uji. Persen pemerangkapan DPPH oleh pakkat segar, pakkat rebus dan
pakkat bakar serta persen pemerangkapan DPPH oleh vitamin C dapat dilihat
pada Tabel 4.1 dan 4.2.
Tabel 4.1 Persen Pemerangkapan DPPH oleh Pakkat Segar, Pakkat Rebus dan
Pakkat Bakar.
% Pemerangkapan
Larutan Konsentrasi
RataUji
(µg/ml)
I
II
III
IV
V
VI
Rata
0
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1000
22,46 22,35 22,37 22,29 22,53 22,61 22,45
Pakkat
2000
39,39 39,24 39,23 39,12 39,05 39,46 39,24
Segar
3000
54,62 55,24 56,89 56,78 57,21 57,43 56,36
4000
71,74 72,03 72,15 72,23 72,10 72,34 72,09
0
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1000
15,71 15,76 15,64 15,75 15,64 15,73 15,71
Pakkat
2000
22,70 22,71 22,61 22,73 22,65 22,69 22,68
Rebus
3000
38,81 38,83 38,74 38,82 38,79 38,83 38,80
4000
53,32 53,34 53,12 53,39 53,36 53,37 53,31
0
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1000
56,36 56,38 56,37 56,37 56,39 56,39 56,37
Pakkat
2000
70,68 70,67 70,68 70,69 70,65 70,62 70,66
Bakar
3000
81,70 81,81 81,72 81,73 81,78 80,51 81,54
4000
96,16 95,85 95,92 95,94 95,92 96,01 95,90
Keterangan: Rata-rata %pemerangkapan 6 kali pengulangan
Tabel 4.2 Persen Pemerangkapan DPPH oleh Vitamin C
Keterangan: Rata-rata %pemerangkapan 6 kali pengulangan
Tabel 4.1 dan 4.2 dapat dilihat bahwa adanya kenaikan persen
pemerangkapan pada DPPH yang diberi pakkat segar, pakkat rebus dan pakkat
24
Universitas Sumatera Utara
bakar serta vitamin C sebagai pembanding dalam metanol pada setiap kenaikan
konsentrasi. Persen pemerangkapan terjadi karena adanya senyawa yang bereaksi
sebagai penangkap radikal yang akan mereduksi DPPH membentuk DPPH-H
yang tereduksi. Reaksi ini diamati dengan adanya perubahan warna DPPH dari
ungu menjadi kuning ketika elektron ganjil dari radikal DPPH telah berpasangan
dengan hidrogen dari senyawa penangkap radikal bebas. Keberadaan antioksidan
dalam tumbuhan akan menetralisasi radikal DPPH dengan memberikan elektron
kepada DPPH, menghasilkan perubahan warna dari ungu menjadi kuning atau
intensitas warna ungu larutan jadi berkurang (Molyneux, 2004). Penghilangan
warna akan sebanding dengan jumlah elektron yang diambil oleh DPPH sehingga
dapat diukur secara spektrofotometri (Garcia, dkk., 2012)
4.2.4 Hasil Analisis Nilai IC50 (Inhibitory Concentration)
Nilai IC50 diperoleh berdasarkan perhitungan persamaan regresi dengan
cara memplot konsentrasi larutan uji dan % peredaman DPPH sebagai parameter
aktivitas antioksidan, konsentrasi sampel (μg/ml) sebagai absis (sumbu X) dan
nilai % inhibisi sebagai ordinat (sumbu Y). Hasil persamaan regresi linier dan
hasil analisis nilai IC50 yang diperoleh dari pakkat segar, pakkat rebus, pakkat
bakar, dan vitamin C dapat dilihat pada Tabel 4.3 dan kategori nilai IC50 sebagai
antioksidan dapat dilihat pada Tabel 4.4.
Tabel 4.3 Hasil Persamaan Regresi Linier dan Hasil Analisis IC50 dari Pakkat
Segar, Pakkat Rebus, Pakkat Bakar, dan Vitamin C
Larutan Uji
Persamaan Regresi
IC50 (μg/ml)
Pakkat Segar
Y= 0,017809x + 2,410
2672,24
Pakkat Rebus
Y= 0,012972x + 2,393
3841,76
Pakkat Bakar
Y= 0,021698x + 17,501
1497,74
Vitamin C
Y= 10,5967 x – 0,975
4,81
25
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.4 Kategori Nilai IC50 sebagai Antioksidan
No.
Kategori
1.
Sangat Kuat
2.
Kuat
3.
Sedang
4.
Lemah
Sumber: Winarsi (2014)
Konsentrasi (µg/ml )
< 50
50-100
101-150
>151
Hasil dari Tabel 4.3 dan 4.4 diatas diketahui bahwa pakkat segar, pakkat
rebus, dan pakkat bakar menunjukkan aktivitas antioksidan kategori sangat lemah
dengan nilai IC50 berturut-turut sebesar 2672,24 μg/ml; 3841,76 μg/ml; dan
1497,74 μg/ml. Dibandingkan dengan vitamin C sebagai kontrol positif yang
termasuk dalam kategori sangat kuat dengan nilai IC50 4,81 μg/ml. Berdasarkan
data yang didapat diketahui bahwa terjadinya penurunan aktivitas antioksidan
pada pakkat rebus dibandingkan dengan pakkat segar dan hal berbeda terjadi pada
pakkat bakar mengalami peningkatan aktivitas antioksidan dibandingkan pakkat
segar.
Penurunan aktivitas antioksidan pada pakkat rebus dibandingkan pakkat
segar kemungkinan terjadi senyawa kimia yang berpotensi sebagai antioksidan
terlarut didalam air perebusan. Hal ini seesuai dengan penelitian yang sebelumnya
menyatakan bahwa proses perebusan mengakibatkan dinding sel dan membran
plasma cepat mengalami kerusakan. Air masuk kedalam dinding sel dan vakuola
kemudian melarutkan senyawa kimia yang berpotensi sebagai antioksidan
kedalam cairan pengolahan (Syaifuddin, 2015).
Peningkatan aktivitas antioksidan pada pakkat bakar dibandingkan pakkat
segar mengalami degradasi kimia dan fisik ketika dilakukan proses pemanasan.
Menurut (Santoso, 2016) senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan seperti
senyawa flavonoid dan senyawa fenolik-fenolik lainnya umumnya ada dalam
26
Universitas Sumatera Utara
bentuk terikat dengan jenis-jenis gula tertentu. Selama proses pemanasan ikatan
gikosidik pecah sehingga dihasilkan bentuk glikon flavonoid. glikon ini
aktivitasnya antioksidannya lebih tinggi daripada yang dalam bentuk terikat
dengan gula.
Penetapan kadar air pada pakkat segar, rebus dan bakar yang telah
dilakukan oleh Lubis (2015), diperoleh masing-masing sebesar 88,68%, 90,66%,
dan 88,25% serta persen rendemen bahan basah menjadi bahan kering masingmasing perlakuan sebesar 11,35%, 11,74%, dan 9,33%. Pakkat segar, pakkat
rebus dan pakkat bakar sejumlah 5 gram akan menghasilkan bahan kering masingmasing 0,567 g, 0,587 g, dan 0,466 g, sehingga nilai IC50 yang dihasilkan dari
bahan kering akan lebih kuat jika dibandingkan bahan basah (segar) dengan
perlakuan yang sama.
Penelitian yang telah dilakukan Aisyah dkk., (2015), aktivitas antioksidan
bahkan menjadi lebih kuat setelah perlakuan panas. Hal yang sama juga telah
dilakukan Turkmen dkk., (2005), menyatakan bahwa kacang polong dan brokoli
setelah dimasak mempunyai jumlah aktivitas antioksidan lebih kuat atau tidak
berubah (tetap) bergantung pada cara pengolahannya.
4.3 Hasil Analisis Kandungan Fenoik Total
4.3.1 Hasil Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Asam Galat
Pengukuran serapan maksimum asam galat dengan penambahan reagen
Folin-Ciocalteu, natrium karbonat 20% serta akuades pada konsentrasi
1000 μg/ml menggunakan spektrofotometri visibel. Kurva serapan panjang
gelombang maksimum dapat dilihat pada Gambar 4.2
27
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.2 Kurva serapan larutan asam galat (1000 μg/ml) secara
spektrofotometri visibel.
4.3.2 Hasil Penentuan Waktu Kerja (Operating Time)
Waktu kerja (operating time) bertujuan untuk mengetahui waktu
pengukuran yang stabil. Waktu kerja ditentukan dengan mengukur hubungan
antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan (Gandjar dan Rohman, 2007)
Lama pengukuran metode Folin-Ciocalteu dilakukan setelah masing-masing
sampel yang telah ditambahkan reagen lalu didiamkan selama 90 menit masa
inkubasinya pada suhu ruangan (Sayuti dan Yenrina, 2015).
Penetapan kandungan fenolik total dimulai dengan melakukan waktu kerja
larutan baku asam galat konsentrasi 1000 µg/ml segera setelah penambahan
reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 20% pada panjang
gelombang 775 nm. Larutan tersebut mulai menghasilkan nilai absorbansi yang
stabil pada menit ke-90, dengan demikian dipilih waktu pendiaman selama 90
menit sejak pencampuran sampel.
28
Universitas Sumatera Utara
4.3.3 Hasil Penentuan Kurva Kalibrasi Asam Galat
Penentuan Kurva kalibrasi asam galat dibuat dengan mengukur absorbansi
larutan asam galat dengan konsentrasi 10 μg/ml, 20 μg/ml, 30 μg/ml, 40 μg/ml,
dan 50 μg/ml dengan penambahan Folin-Ciocalteu, natrium karbonat 20% serta
akuades pada panjang gelombang 775 nm. Nilai absorbansi standar asam galat
dapat diihat pada Tabel 4.5.
Tabel 4.5 Nilai Absorbansi Standar Asam Galat
Sampel
Konsentrasi (µg/ml)
(x)
Absorbansi
(y)
0
0,00009
10
0,06180
20
0,13573
30
0,20044
40
0,26804
50
0,33528
Asam Galat
Persamaan Regresi
Y = 0,00674X 0,0016
Berdasarkan tabel tersebut diperoleh kurva kalibrasi larutan asam galat seperti
ditunjukkan pada Gambar 4.3 berikut:
0,4
Absorbansi
0,3
0,2
y = 0.00674x - 0.0016
r = 0.9997
0,1
0
-0,1
0
10
20
30
40
50
60
Konsentrasi (µg/ml)
Gambar 4.3 Kurva Kalibrasi Larutan Standar Asam Galat
Kurva kalibrasi didapat dari hubungan berbagai kadar asam galat dengan
absorbansi yang terbentuk. Berdasarkan kurva kalibrasi ini diperoleh nilai
koefisien korelasi (r). Nilai koefisien korelasi berkisaran antara 0 sampai 1 yang
menunjukkan seberapa dekat nilai perkiraan untuk analisis regresi yang mewakili
29
Universitas Sumatera Utara
data yang sebenarnya. Berdasarkan kurva kalibrasi diatas diperoleh persamaan
garis regresi y = 0.00674x - 0.0016 dengan nilai Koefisien korelasi = 0,9997.
4.3.4 Hasil Penentuan Kandungan Fenolik Total pada Pakkat
Kandungan fenolik total dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Untuk
menentukan kandungan fenolik total digunakan asam galat sebagai standar. Nilai
absorbansi dari pakkat segar, pakkat rebus dan pakkat bakar diplotkan terhadap
kurva standar asam galat dan dihitung senyawa fenoliknya. Hasil Kandungan
fenolik total dari pakkat segar, pakkat rebus dan pakkat bakar dapat dilihat pada
Tabel 4.6.
Tabel 4.6 Hasil kandungan fenolik total dari pakkat segar, pakkat rebus dan
pakkat bakar
Volume
Kadar
Rata-Rata Kadar
Larutan
Larutan Sampel Absorbansi Total Fenol
Fenolik Total
Uji
(ml)
(mg/g)
(mg GAE/g)
0,0995
2,2964
0,0995
2,9661
0,0996
2,9673
Pakkat
10
2,9674
Segar
0,0998
2,9723
0,0996
2,9673
0,0996
2,9673
0,0585
1,7777
0,0582
1,7642
0,0587
1,7798
Pakkat
10
1,7780
Rebus
0,0590
1,7886
0,0589
1,7848
0,0585
1,7730
0,1997
5,9629
0,1999
5,9685
0,2001
5,9732
Pakkat
10
5,9856
Bakar
0,2005
5,9866
0,2010
6,0019
0,2016
6,0188
Keterangan: Kandungan fenolik total yang diperoleh adalah kadar rata-rata total
fenol 6 kali pengulangan
30
Universitas Sumatera Utara
Berdasarkan Tabel 4.6 dapat dillihat kadar kandungan fenolik total dari
pakkat
segar,
pakkat
rebus
dan
pakkat
bakar
berturut-turut
sebesar
2,9674 mg GAE/g; 1,7780 mg GAE/g; dan 5,9856 mg GAE/g. Berdasarkan data
yang didapat diketahui bahwa terjadi penurunan kadar fenolik total pada pakkat
rebus sebesar 40,07%
dibandingkan dengan pakkat segar. Penurunan kadar
kandungan fenolik total setelah perebusan diduga karena larutnya fenol dalam air.
Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air karena umumnya mereka sering
kali berikatan dengan gula sebagai glikosida, dan biasanya terdapat dalam vakuola
sel (Harbone, 1987).
Sebaliknya, hal berbeda terjadi pada pakkat bakar mengalami peningkatan
kadar fenolik total sebesar 101,75% dibandingkan pakkat segar. Hal ini karena
pengolahan dengan cara pembakaran menyebabkan kandungan air yang terdapat
didalam sampel akan menguap sehingga senyawa fenol yang didapat lebih tinggi.
Selain itu setiap tanaman memiliki berbagai jenis senyawa fenolik yang berbedabeda menyebabkan terjadinya pembelahan fenolik yang mempunyi kandungan
fenolik yang lebih tinggi atau lebih rendah sesuai dengan jenis tanaman dan panas
yang diterapkan (Ramdhan dan Aminah, 2014) .
31
Universitas Sumatera Utara
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
a. Hasil perhitungan nilai IC50 dari pakkat segar, rebus, dan bakar diperoleh
dengan nilai IC50 masing-masing sebesar 2672,24 μg/ml; 3841,76 μg/ml; dan
1497,74 μg/ml menunjukkan kekuatan antioksidan dalam kategori sangat
lemah.
b. Kadar fenolik total pada pakkat yang segar, rebus dan bakar masing-masing
sebesar 2,9674 mg GAE/g; 1,7780 mg GAE/g; dan 5,9856 mg GAE/g dengan
metode Folin-Ciocalteu.
5.2 Saran
a. Disarankan kepada masyarakat untuk mengkonsumsi pakkat bakar karena
aktivitas antioksidan lebih tinggi dibandingkan dengan pakkat segar dan
pakkat rebus.
b. Disarankan kepada peneliti selanjutnya untuk melakukan ekstraksi dengan
pelarut polar.
32
Universitas Sumatera Utara