EKSPRESI GEN TNF-α INDIVIDU DENGAN HIPERTENSI | Sabir | Medika Tadulako: Jurnal Ilmiah Kedokteran Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan 7937 26071 1 PB

EKSPRESI GEN TNF -

α

INDIVIDU DENGAN HIPERTENSI

M.Sabir

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Tadulako

ABSTRAK

Telah dilakukan penelitian ekspresi gen TNF-α pada individu dengan hipertensi. Tujuan penelitian ini untuk mendeteksi ekspresi gen TNF-α pada individu dengan hipertensi. TNF-α merupakan salah satu mediator imun yang berperan pada inflamasi vaskuler baik akut maupun kronik. Pada individu dengan hipertensi terdapat sirkulasi TNF-α yang tinggi dan abnormal yang memiliki korelasi terhadap besarnya tekanan darah. Jumlah sampel yang digunakan sebanyak 25 sampel dari individu hipertensi dan individu sehat normotensi. Uji teknik RT-PCR dilakukan di Laboratorium Imunologi dan Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi gen TNF-α pada individu hipertensi meningkat lebih tinggi dibandingkan dengan orang sehat.

Kata kunci : Hipertensi, TNF -α, Inflamasi vaskular ABSTRACT

A research has been done about the Analyze of TNF -α Gene Expression in Hypertension. This research was aimed to detect of TNF-α gene expression in hypertension. TNF-α is an immune system that takes a role in acute and cronic of vascular inflamation. In many kinds of hypertension patients, there is a high and abnormal of TNF -α circulation and has been correlated with blood pressure level. Twenty five samples were taken from hypertension patients and health body (normotension) blood. Technical assay of RT-PCR was done in Molecular Biology and Immunology Laboratory of Medical Faculty of Hasanuddin University. The result indicated that TNF-α gene expression in hypertension was more increased than in health body cell.

Pendahuluan

Hipertensi disebut sebagai “The

silent killer” karena tidak menimbulkan gejala hingga komplikasi mulai terjadi, sekitar separuh orang yang menderita hipertensi tidak menyadarinya. Selain itu sebagian besar orang beranggapan hipertensi sebagai gejala dari suatu penyakit bukan sebagai penyakit atau suatu keadaan abnormal yang primer (berdiri sen-diri). Kenyataannya hipertensi merupakan salah satu dari tujuh penyebab kematian utama di dunia selain mengakibatkan kerusakan pada organ jantung, otak dan ginjal (1).

Di seluruh dunia hampir 1 miliar orang dewasa atau sekitar se-perempat dari seluruh populasi orang dewasa menyandang hipertensi, jumlah ini cenderung meningkat. Pada populasi usia lanjut, angka penyandang hipertensi lebih banyak dialami oleh lebih dari separuh populasi usia di atas 60 tahun (2).

Kurang lebih 90 – 95 % hipertensi ialah primer dan idiopatik (esensial) yang lebih banyak berhubungan dengan kelainan genetik dan sisanya 5 % adalah hipertensi sekunder (non esensial) yang kebanyakan berhubungan dengan penyakit ginjal, stenosis arteri renalis (reno-vaskuler),

kelainan endokrin maupun gangguan neurologik (2,3).

Beberapa penelitian sebelumnya menunjukan bahwa inflamasi kronik merupakan salah satu bagian terhadap patogenesis vaskuler (4). Kelainan patologi vaskuler dapat disebabkan oleh interaksi antara sel imun dan dinding vaskuler yang maladaptif yakni melalui aktivasi mediator atau sitokin proinflamasi yang berlebihan (abnormal). Pelepasan mediator inflamasi yang abnormal ini diakibatkan oleh adanya ekspresi gen yang tidak terkendali oleh sistem imunitas yang ada. Salah satu sitokin yang berperan penting pada proses inflamasi vaskuler adalah Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) (5).

TNF-α adalah imunitas pleitropik

yang diproduksi monosit -makrofag, sel T yang diaktifkan, sel NK, sel endotel dan otot polos. TNF-α berperan penting dan merupakan dasar yang sangat penting dalam proses inflamasi vaskuler, aterosklerosis dan infark miokard. Pada kadar rendah TNF-α berperan terhadap sel endotel dan pada kadar tinggi ber-peran terhadap resistensi vaskuler (5).

PCR adalah suatu metode untuk mengamplifikasi sekuens gen target secara eksponensial in vitro dan telah berkembang menjadi teknik utama dalam laboratorium

biologi molekuler yang dapat digunakan untuk mendeteksi suatu ekspresi gen. Selain itu juga PCR telah digunakan secara luas dalam bidang kedokteran untuk analisa berbagai penyakit menular, keganasan dan kelainan genetika. Pada reaksi ini dibutuhkan DNA target, sepasang primer, polimerase DNA yang termostabil dan buffer reaksi (6).

Berdasarkan latar belakang di atas, maka diperoleh rumusan masalah dari penelitian ini adalah apakah ada peningkatan ekspresi gen TNF-α pada individu hipertensi dibandingkan individu normal dengan menggunakan metode RT-PCR (12). Tujuan penelitian ini adalah mendeteksi ekspresi gen TNF-α pada individu hipertensi. Manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat menambah informasi ilmiah mengenai peran gen TNF-α terhadap perkembangan hipertensi dan dapat dijadikan sebagai salah satu petunjuk dalam penelitian hipertensi.

Desain Penelitian

Penelitian ini dilakukan secara observasional dengan pendekatan Cross Sectional Study untuk mendeteksi adanya ekspresi gen TNF-α pada individu hipertensi dan individu normotensi dengan menggunakan metode RT-PCR (12,18).

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian telah dilakukan pada bulan April hingga Mei 2013 dan dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler dan Imunologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Hasanuddin Makassar.

Subjek dan Cara Pemilihan

Subjek penelitian meliputi semua populasi terjangkau yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi. Pemeriksaan ekspresi gen TNF-α dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler dan Imunologi, Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran, Universitas Hasanuddin.

Kriteria sampel 1. Inklusi

Sampel berasal dari penderita yang telah didiagnosa menderita hipertensi (≥ 140/90 mmHg).

2. Eksklusi

Penyakit kardiovaskuler, gagal ginjal, diabetes melitus, kehamilan dan pasien dalam terapi obat anti hipertensi dan anti inflamasi.

Jenis sampel

Sampel dalam penelitian darah vena individu dengan hipertensi dan orang

normal (normotensi) yang memenuhi kriteria serta bersedia diikutkan dalam penelitian ini. Teknik pengambilan sampel secara accidental sampling yaitu pengambilan sampel berdasarkan kejadian atau kemunculan pada saat penelitian berlangsung.

Perkiraan Besar Sampel

Besar sampel diperkirakan berdasarkan rumus (16):

n =

keterangan :

- n = Besar sampel

- N = Besar proporsi populasi (27,33) - d = Tingkat kepercayaan yang

diinginkan (ditetapkan), nilainya (p) = 0,05

Data rekam medik yang diambil di Rumah Sakit Wahidin Sudirohusodo, menunjukkan bahwa jumlah keseluruhan pasien hipertensi rawat jalan selama tahun 2012 adalah 328 orang (dengan proporsi 27.33).

Jadi n = = 25,29

dibulatkan menjadi 25 sampel

Definisi Operasional

1. TNF-α adalah sitokin proinflamasi

yang diproduksi oleh sel makrofag, sel T yang diaktifkan, sel NK, sel endotel, berperan penting dalam proses inflamasi akut dan vaskuler (5). 2. PCR adalah metode untuk

mengamplifikasi sekuens gen target secara eksponensial in vitro menggunakan DNA target, primer dan enzim polimerase (14).

Alat dan Bahan 1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah elektoforesis, mesin PCR, gyraroty shaker, inkubator, mikropipet 10 µl,100 µl dan 1000 µl, sentrifus, vortex dan oven.

2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel darah vena individu hipertensi dan sampel darah vena orang sehat (normotensi), buffer L6, suspensi diatom, buffer L2, etanol 70 %, aseton, destilat water, PCR mix, ethidium bromida, gel agarose 2 %, microcup, tabung eppendorf, primer yang terdiri atas (15,17) :

N

1 + N (d

2

₎

27,33

1 + 27,33 (0.05)

2

1. TNF-α :

5’-CAGCCTCTTCTCCTTCCTGAT-γ’ dan

5’GCCAGAGGGCTGATTAGAGA-γ’

2. -actin :

5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-γ’ dan

5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATT TC-3’

Prosedur Kerja

1. Pengukuran tekanan darah

Pasien dibiarkan rileks 5 menit sebelum pengukuran tekanan darah. Atur posisi tangan minimal sejajar dengan letak jantung dan tidak terlalu rendah. Pasang manset pada lengan atas 2 – 3 cm di atas lipatan siku dan stetoskop pada arteri tepat di bawah manset untuk mendengar bunyi arteri. Pompa manset sampai pada tekanan di antara tekanan sistolik dan tekanan diastolik yang terbaca pada skala (≥ 160 mmHg). Manset dikempiskan secara perlahan-lahan sampai timbul bunyi. Bunyi pertama kali terbaca sebagai tekanan sistolik dan hilangnya bunyi pertama kali terbaca sebagai tekanan diastolik, kemudian catat hasil (2).

2. Pengambilan darah vena

Bersihkan tempat pengambilan darah dengan alkohol 70% dan biarkan kering kembali. Pasang pembendung pada lengan atas, minta pasien agar mengepal dan membuka tangannya berkali-kali agar vena jelas terlihat. Tegangkan kulit dengan menggunakan jari, agar vena tidak bergerak. Tusuk kulit dengan jarum yang terpasang pada holder. Ketika darah mulai mengalir pembendung dilepaskan. Jika volume darah telah mencukupi, tabung darah dilepaskan dari holder. Letakkan kapas di atas jarum dan jarum ditarik perlahan-lahan. Pasien diminta menekan tempat pengambilan darah dengan kapas, kemudian diberi plester (7,8).

3. Pengambilan sampel

Sampel berupa darah vena yang berasal dari individu hipertensi dan orang normal, dimasukkan pada microcup yang berisi larutan buffer L6 sebanyak masing-masing sebanyak 1-2 tetes.

4. Pemeriksaan PCR

a. Ekstrasi RNA TNF-α yang berasal dari darah vena penderita hipertensi dan orang normal dengan metode Boom.

Darah vena sebanyak 100 µl dimasukkan ke dalam microcup lalu

ditambahkan 900 µl larutan buffer L6 dan dihomogenkan pada gyraroty shaker. Campuran kemudian disentrifus dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit, lalu ditambahkan 30 µl suspensi diatom kemudian dilakukan vortex dan disentrifus di dalam tabung eppendorf dengan kecepatan 12000 rpm selama 30 detik. Supernatan dipisahkan dan dicuci dengan larutan L2 dan dilanjutkan dengan etanol 70 % sebanyak 2 kali dan aseton 1 kali. Setelah itu dipanaskan pada suhu 56o_C

pada oven selama 10 menit dan ditambahkan 60 µl destilate water. Kemudian dilakukan vortex. Tabung eppendorf tersebut diinkubasi dalam oven pada suhu 56o_{C selama 10 menit,}

kemudian disentrifus dengan kecepatan 12000 rpm selama 15 detik dan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf yang baru. Supernatan dari proses ini merupakan hasil ekstraksi yang mengandung RNA dan disimpan pada suhu – 20o_{C untuk dilakukan analisa PCR}

(10,13).

b. Amplifikasi RNA TNF-α dengan teknik RT-PCR

Hasil ekstraksi RNA sebanyak 2,5 µl ditambah 22,5 µl PCR mix dan dimasukkan ke dalam tabung 250 µl.

Tabung dimasukkan dalam mesin PCR. Program amplifikasi dibuat berlangsung selama 40 siklus, yang tiap siklus terdiri dari :

1. Denaturasi dengan jalan pemisahan dari pasangan untai-DNA, pada suhu 950 _{C selama 30 detik}

2. Annaeling yaitu pengikatan primer dengan untai-DNA yang sesuai pada suhu 560 _{C selama 30 detik}

3. Elongating yaitu perpanjangan ikatan antara primer dengan untai-DNA yang telah terikat, pada susu 720 _{C selama 30 detik}

Hasil PCR kemudian dianalisa dengan menggunakan metode

elektroforesis (6,14,15).

c. Analisa hasil PCR dengan metode Elektroforesis menggunakan gel agarose 2 %

Ke dalam tangki elektroforesis, dimasukkan produk amplifikasi yang ditambahkan larutan pengembang (gel loading buffer) sebanyak 2 µl lalu dimasukkan ke dalam sumur- sumur gel agarosa. Elektroforesis dijalankan dengan elektroda 220 volt, sehingga DNA akan bergerak ke kutub positif. Hasil elektroforesis dapat dilihat dengan bantuan lampu ultraviolet. Pita DNA dapat

divisualisasikan dengan kamera. Pita DNA dari sampel dibandingkan dengan pita

internal kontrol -actin. Hasil pemeriksaan

pada teknik PCR dikatakan positif yaitu jika terbentuk pita DNA TNF-α pada elektroforesis dengan pasangan basa (bp) 123 bp dan terbentuk pita internal kontrol -actin pada elektroforesis dengan pasangan basa (bp) 540 bp (11,15).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Penelitian

Penelitian mengenai ekspresi gen

TNF-α pada penderita hipertensi dan

normotensi (normal) dengan metode RT-PCR (Reverse Transciptase-PCR) telah dilakukan dengan jumlah 25 sampel.

Berdasarkan hasil yang diperoleh menunjukan bahwa adanya ekspresi gen

TNF-α dimana peningkatan terjadi pada

sampel hipertensi nomor 1 dan 7 seperti terlihat pada tabel 3.

Tabel 3. Sampel hipertensi berdasarkan umur, jenis kelamin dan tekanan darah

Pada tabel 4 menunjukan data ekspresi gen TNF-α dari sampel darah penderita hipertensi dimana nilai +1 sebanyak 2 orang dan +2, +3, +4, +5 tidak ada (0).

Tabel 4. Data ekspresi gen TNF-α pada penderita hipertensi

Berdasarkan data tersebut dilakukan perhitungan mean ekspresi gen

TNF-α dari sampel tersebut dengan hasil

yang diperoleh adalah 0,16 dan persentase ekspresi gen TNF-α pada populasi hipertensi (tabel 5).

Tabel 5. Persentase ekpresi gen TNF-α pada populasi hipertensi berdasarkan tekanan darah

Hasil uji PCR sampel penderita hipertensi diperoleh peningkatan gen TNF-α sebanyak β dari 1β sampel orang (16,7 %), berdasarkan te-kanan darah peningkatan terjadi pada tekanan darah 150/80 mmHg (8,33%) dan >160/90 mmHg (8,33 %).

Hasil elektroforesis ditandai dengan terbentuknya pita DNA TNF-α pada pasangan basa sebesar 123 bp dan

terbentuknya pita internal kontrol -actin

pada elektroforesis dengan pasangan basa sebesar 540 bp. Dimana sampel 1 dan 7 terlihat lebih tebal dibandingkan dengan yang lainnya (gambar 3).

Gambar 3. Hasil Elektroforesis tampak pita TNF-α pada posisi 1βγ bp dan pita internal kontrol -actin pada posisi 540 bp dengan RT PCR. M=Marker; No.1-12 = sampel penderita hipertensi.

Secara keseluruhan pada individu hipertensi terjadi peningkatan ekspresi gen

TNF-α sebanyak 16,7% (diagram 1)

Pada tabel 6 menunjukan hasil pemeriksaan gen TNF-α dari sampel orang normal (normotensi) sebanyak 13 sampel, hasil yang diperoleh adalah tidak adanya peningkatan ekspresi seperti pada individu hipertensi

Tabel 6. Sampel orang normal berdasarkan umur, jenis kelamin dan tekanan darah

Pada tabel 7 menunjukan data ekspresi gen TNF-α dari sampel darah orang normal dimana nilai +1 ,+2, +3, +4, +5 tidak menunjukan adanya peningkatan (0).

Tabel 7. Data ekspresi gen TNF-α pada orang normal (normotensi)

Berdasarkan data tersebut dilakukan perhitungan mean ekspresi gen

TNF-α dari sampel tersebut dengan hasil

yang diperoleh adalah 0.

Hasil elektroforesis menunjukkan tidak adanya penebalan pita DNA TNF-α pada elektroforesis yang menunjukan bahwa tidak adanya peningkatan ekspresi (gambar 4).

Gambar 4. Hasil Elektroforesis tampak pita

TNF-α pada posisi 1βγ bp dan

pita internal kontrol -actin

pada posisi 540 bp dengan RT PCR. M=Marker; No.13-25 = sampel orang normal (normotensi)

Secara umum dari keseluruhan populasi sampel baik hipertensi maupun normal menunjukkan bahwa terjadi peningkatan ekspresi sebanyak 8% yang terdapat pada populasi hipertensi dan sisanya 92 % tidak mengalami peningkatan

ekspresi yang sebagian besar terdapat pada orang normal (tabel 8 dan diagram 2). Tabel 8. Persentase ekpresi gen TNF-α

pada populasi hipertensi dan normal

Pembahasan

Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret hingga April 2012 dengan menggunakan 25 sampel yang berasal dari penderita hipertensi dan orang normal (normotensi) menggunakan metode RT-PCR. Tujuan dari peneli-tian ini adalah untuk melihat apakah ada peningkatan ekspresi gen TNF-α pada penderita hipertensi dibandingkan dengan orang normal.

Pemilihan pemeriksan TNF-α sebagai subyek penelitian karena selain diproduksi oleh makrofag, TNF-α juga

disintesis oleh sel endotel yang merupakan penyusun utama tunika intima vaskuler yang berperan dalam regulasi tekanan darah (tahanan perifer) melalui produksi zat vasoaktif salah satunya adalah Nitrit oksida (NO) (7). Jika terjadi kerusakan pada sel endotel maka TNF-α akan diekspresikan sebagai mediator proinflamasi dan transduksi sinyal antar sel. Kadar TNF-α yang diekspresikan sebanding dengan tingkat kerusakan yang ditimbulkan (5).

RT-PCR digunakan dalam penelitian ini karena teknik tersebut dapat menganalisis mRNA. mRNA yang diekspresikan oleh gen TNF-α akan diubah menjadi cDNA dengan menggunakan enzim reverse transcriptase, baru kemudian dilakukan amplifikasi PCR. Pada penelitian ini, -actin digunakan sebagai internal kontrol untuk melihat kualitas dari pemeriksaan PCR (18). -actin merupakan housekeeping gene yang diekspresikan oleh semua jenis sel dan secara umum ekspresinya tidak dipengaruhi oleh kondisi eksperimental dan selalu hadir dalam kondisi apapun (13,15).

Berdasarkan hasil yang diperoleh bahwa pada sampel orang normal dengan tekanan darah yang normal (≤ 1β0/80 mmHg) tidak menunjukkan adanya peningkatan. Hal ini sesuai teori bahwa

pada ke-adaan normal TNF-α merupakan mediator non-preformed yang hanya dilepaskan pada saat dibutuhkan seperti ketika tubuh terpapar benda asing atau adanya gangguan dalam tubuh (abnormal) (5,9).

Pada sampel hipertensi terjadi peningkatan ekspresi gen TNF-α pada tekanan darah yang tinggi yakni 150/80 – 160/90 mmHg. Hipertensi dapat terjadi karena resistensi perifer sebagai akibat disfungsi endotel atau sebaliknya. Kadar

TNF-α yang tinggi (≥ 10-7 _{M) diketahui}

berperan penting terhadap resistensi perifer. Tekanan darah yang tinggi dan persisten dapat menimbulkan kerusakan berupa resistensi perifer, kadar TNF-α yang dilepaskan sebanding dengan tingkat kerusakan yang terjadi (5). Berdasarkan hal tersebut ekspresi TNF-α pada orang dengan tekanan darah tinggi (hipertensi) lebih banyak dibandingkan dengan orang dengan tekanan darah normal (normotensi) maupun rendah (hipotensi) (4,9,15).

Hal di atas belum bisa dijadikan sebagai acuan yang pasti, karena dari hasil penelitian pada sampel penderita hipertensi dengan tekanan darah yang sama (150/80 mmHg) diperoleh bahwa tidak adanya peningkatan ekpresi gen TNF-α. Sebagaimana diketahui bahwa dalam

mekanisme kerjanya, ekpresi gen TNF-α diatur dan dipengaruhi oleh multifaktorial seperti hormon (hormon steroid), molekul sinyal (cAMP) dan peptida faktor pertumbuhan termasuk sitokin IL-1 (Interleukin-1), 12 (Interleukin-12), IL-10 (Interleukin-IL-10), IFN- (Interferon- ) dan VEGF (Vasculer endothelial Growth Factor) (16). Selain itu, regulasi ekspresi

TNF-α juga diinduksi oleh reseptor TNF-α

sendiri. Pengikatan TNF-α dengan reseptornya (TNFR1 dan TNFR2) menimbulkan amplifikasi sinyal TNF-α. Sistem regulasi faktor-faktor tersebut mempunyai kepekaan yang berbeda pada setiap orang termasuk sistem imunitas. Sehingga meskipun berada pada keadaan tekanan darah yang sama, akan tetapi respon tubuh dapat berbeda-beda. Selain itu, tidak adanya peningkatan ekspresi gen

TNF-α dapat dipengaruhi oleh

antihipertensi dan antiinflamasi yang dikonsumsi penderita hipertensi.

SIMPULAN DAN SARAN

1. Simpulan

Individu dengan hipertensi terjadi peningkatan ekspresi gen TNF-α sebesar 8% dibandingkan dengan individu normal.

2. Saran

Perlu adanya penelitian untuk melihat ekspresi sitokin anti-inflamasi pada individu dengan hipertensi.

DAFTAR PUSTAKA

1. Beevers D. G. Tekanan Darah. Simbolon OH. Dian Rakyat. Jakarta. 2002. Hal 16 - 28

2. Palmer A, Williams B. Tekanan Darah Tinggi. Terjemahan oleh Yasmine E. Erlangga. Jakarta. 2005. Hal 10-59 3. Robbins, Cotran & Kumar. Dasar

Patologi Penyakit. Ed. 5. Terjemahan oleh Tjarta A, Himawan S, Kurniawan AN, Sadikin V & Halim A. Jakarta; EGC. 1999. Hal 293 – 294

4. Boos CJ & Lip HJY. Is Hypertension an Inflammatory Process. Current Pharm. Design. 2006(12). pp. 1263, 1267 -1268 5. Baratawijaya KG. Imunologi Dasar. Ed.

7. Balai Penerbit FKUI. Jakarta. 2006. Hal 124, 384 – 389

6. Putra ST. Biologi Molekuler Kedokteran. Airlangga University Press. Surabaya. 1999. Hal 165

7. The Seven Report of The Joint of National Committee. Prevention, Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure. JNC 7 Express. [diakses 9 Februari 2011]. Available

from :

www.nih.gov/guidelines/hypertension/e xpress.pdf

8. Pickering TG, Hall JE, Appel LJ, Falkner BE, Graves J, Hill MN, et al. Recommendations For Blood Pressusre Measurement In Humans And Experimental Animals. [diakses 9 Februari 2011]. Available from : http://hyper.ahajournals.org/cgi/full/45/ 1/142

9. Whiteside TL. Introduction to Cytokines as Targets for Immunomodulation. In: House RV, Descotes J, editors. Cytokines in Human Health: Immunotoxicology, Pathology, and Therapeutic Applications. Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey. 2007. pp. 1-12

10. Twyman R. Gene Expression. The Human Genome. 8 Januari 2003; [dikutip 7 Februari 2010]. Available at: http://genome.wellcome.ac.uk

11. Azhar TN. Dasar – Dasar Biologi Molekuler. Widya Padjadjaran. Bandung. 2008. Hal 52, 69-81

12. Hatta M. Advance Experimental in Medical Biology. Plenum Publisher. New York. 2003. pp 269-278. Available as PDF file

13. Boom R, Col CJA. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. Journal of Clinical Microbiology. New York. 1990 ;(28). pp 495-503. Available as PDF file 14. Yuwono T. Teori dan Aplikasi

Polymerase Chain Reaction. Penerbit Andi. Yogyakarta. 2006. hal. 10-16 15. Aust G. Competitive RT-PCR to

Quantify Small Amounts of mRNA. In: De Ley M, editor. Cytokine Protocols.

Humana Press. Totowa. 2007. pp 31-40. Available as PDF file

16. Notoatmodjo S. Metodelogi Penelitian Kesehatan. Bingkai cipta. Jakarta. 2005. Hal 92

17. Buckingham L, Flaws ML. Molecular Diagnostics. Davis Company. New York. 2007. pp. 72-77,81

18. Guiletty A, Overbergh L. An Overview of Real-Time Quantitative PCR: Applications to Quantify Cytokine Gene Expression. Ideal. [serial on the internet]. 2001[dikutip 23 Februari 2011]; Vol.25 [8 screen]. Available from: http://www.idealibrary.com

LAMPIRAN 1 DNA Manusia untuk TNF-α >tnf-a mRna-AK314960

1 agacgctccc tcagcaagga cagcagagga ccagctaaga gggagagaag caactacaga 61 ccccccctga aaacaaccct cagacgccac

atcccctgac aagctgccag gcaggttctc 121 ttcctctcac atactgaccc acggctccac

cctctctccc ctggaaagga caccatgagc 181 actgaaagca tgatccggga cgtggagctg

gccgaggagg cgctccccaa gaagacaggg 241 gggccccagg gctccaggcg gtgcttgttc

ctcagcctct tctccttcct gatcgtggca

301 ggcgccacca cgctcttctg cctgctgcac tttggagtga tcggccccca gagggaagag 361 ttccccaggg acctctctct aatcagccct ctggc

ccagg cagtcagatc atcttctcga

421 accccgagtg acaagcctgt agcccatgtt gtagcaaacc ctcaagctga ggggcagctc 481 cagtggctga accgccgggc caatgccctc

ctggccaatg gcgtggagct gagagataac 541 cagctggtgg tgccatcaga gggcctgtac

ctcatctact cccaggtcct cttcaagggc 601 caaggctgcc cctccaccca tgtgctcctc

661 taccagacca aggtcaacct cctctctgcc atcaagagcc cctgccagag ggagacccca 721 gagggggctg aggccaagcc ctggtatgag

cccatctatc tgggaggggt cttccagctg 781 gagaagggtg accgactcag cgctgagatc

aatcggcccg actatctcga ctttgccgag 841 tctgggcagg tctactttgg gatcattgcc ctgtga

Forward : cagcctcttctccttcctgat

Reverse : gccagagggctgattagaga TCTCTAATCAGCCCTCTGGC (Complementary Reverse) // > best β-actin X00351

1 ttgccgatcc gccgcccgtc cacacccgcc gccagctcac catggatgat gatatcgccg 61 cgctcgtcgt cgacaacggc tccggcatgt

gcaaggccgg cttcgcgggc gacgatgccc 121 cccgggccgt cttcccctcc atcgtggggc

gccccaggca ccagggcgtg atggtgggca 181 tgggtcagaa ggattcctat gtgggcgacg

aggcccagag caagagaggc atcctcaccc 241 tgaagtaccc catcgagcac ggcatcgtca

ccaactggga cgacatggag aaaatctggc 301 accacacctt ctacaatgag ctgcgtgtgg

ctcccgagga gcaccccgtg ctgctgaccg 361 aggcccccct gaaccccaag gccaaccgcg

agaagatgac ccagatcatg tttgagacct 421 tcaacacccc agccatgtac gttgctatcc

aggctgtgct atccctgtac gcctctggcc 481 gtaccactgg catcgtgatg gactccggtg

acggggtcac ccacactgtg cccatctacg 541 aggggtatgc cctcccccat gccatcctgc

gtctggacct ggctggccgg gacctgactg 601 actacctcat gaagatcctc accgagcgcg

gctacagctt caccaccacg gccgagcggg 661 aaatcgtgcg tgacattaag gagaagctgt

gctacgtcgc cctggacttc gagcaagaga 721 tggccacggc tgcttccagc tcctccctgg

agaagagcta cgagctgcct gacggccagg 781 tcatcaccat tggcaatgag cggttccgct

gccctgaggc actcttccag ccttccttcc 841 tgggcatgga gtcctgtggc atccacgaaa

ctaccttcaa ctccatcatg aagtgtgacg 901 tggacatccg caaagacctg tacgccaaca

cagtgctgtc tggcggcacc accatgtacc

961 ctggcattgc cgacaggatg cagaaggaga tcactgccct ggcacccagc acaatgaaga 1021 tcaagatcat tgctcctcct gagcgcaagt

actccgtgtg gatcggcggc tccatcctgg 1081 cctcgctgtc caccttccag cagatgtgga

tcagcaagca ggagtatgac gagtccggcc 1141 cctccatcgt ccaccgcaaa tgcttctagg

cggactatga cttagttgcg ttacaccctt 1201 tcttgacaaa acctaacttg cgcagaaaac

aagatgagat tggcatggct ttatttgttt 1261 tttttgtttt gttttggttt tttttttttt tttggcttga

ctcaggattt aaaaactgga

1321 acggtgaagg tgacagcagt cggttggagc gagcatcccc caaagttcac aatgtggccg 1381 aggactttga ttgcacattg ttgttttttt

aatagtcatt ccaaatatga gatgcattgt 1441 tacaggaagt cccttgccat cctaaaagcc

accccacttc tctctaagga gaatggccca 1501 gtcctctccc aagtccacac aggggaggtg

atagcattgc tttcgtgtaa attatgtaat

1561 gcaaaatttt tttaatcttc gccttaatac ttttttattt tgttttattt tgaatgatga

1621 gccttcgtgc ccccccttcc ccctttttgt cccccaactt gagatgtatg aaggcttttg 1681 gtctccctgg gagtgggtgg aggcagccag

ggcttacctg tacactgact tgagaccagt 1741 tgaataaaag tgcacacctt a

Forward : gtggggcgccccaggcacca

Reverse : ctccttaatgtcacgcacgatttc GAAATCGTGCGTGACATTAAGGAG (Complementary Reverse)

Hasil elektroforesis ditandai dengan terbentuknya pita DNA TNF-α pada pasangan basa sebesar 123 bp dan terbentuknya pita internal kontrol -actin pada elektroforesis dengan pasangan basa sebesar 540 bp. Dimana sampel 1 dan 7 terlihat lebih tebal dibandingkan dengan yang lainnya (gambar 3).

Gambar 3. Hasil Elektroforesis tampak pita TNF-α pada posisi 1βγ bp dan pita internal kontrol -actin pada posisi 540 bp dengan RT PCR. M=Marker; No.1-12 = sampel penderita hipertensi.

Secara keseluruhan pada individu hipertensi terjadi peningkatan ekspresi gen TNF-α sebanyak 16,7% (diagram 1)

Pada tabel 6 menunjukan hasil pemeriksaan gen TNF-α dari sampel orang normal (normotensi) sebanyak 13 sampel, hasil yang diperoleh adalah tidak adanya peningkatan ekspresi seperti pada individu hipertensi

Tabel 6. Sampel orang normal berdasarkan umur, jenis kelamin dan tekanan darah

Pada tabel 7 menunjukan data ekspresi gen TNF-α dari sampel darah orang normal dimana nilai +1 ,+2, +3, +4, +5 tidak menunjukan adanya peningkatan (0).

Tabel 7. Data ekspresi gen TNF-α pada orang normal (normotensi)

Berdasarkan data tersebut dilakukan perhitungan mean ekspresi gen TNF-α dari sampel tersebut dengan hasil yang diperoleh adalah 0.

Hasil elektroforesis menunjukkan tidak adanya penebalan pita DNA TNF-α pada elektroforesis yang menunjukan bahwa tidak adanya peningkatan ekspresi (gambar 4).

Gambar 4. Hasil Elektroforesis tampak pita TNF-α pada posisi 1βγ bp dan pita internal kontrol -actin pada posisi 540 bp dengan RT PCR. M=Marker; No.13-25 = sampel orang normal (normotensi)

Secara umum dari keseluruhan populasi sampel baik hipertensi maupun normal menunjukkan bahwa terjadi peningkatan ekspresi sebanyak 8% yang terdapat pada populasi hipertensi dan sisanya 92 % tidak mengalami peningkatan

ekspresi yang sebagian besar terdapat pada orang normal (tabel 8 dan diagram 2). Tabel 8. Persentase ekpresi gen TNF-α

pada populasi hipertensi dan normal

Pembahasan

Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret hingga April 2012 dengan menggunakan 25 sampel yang berasal dari penderita hipertensi dan orang normal (normotensi) menggunakan metode RT-PCR. Tujuan dari peneli-tian ini adalah untuk melihat apakah ada peningkatan ekspresi gen TNF-α pada penderita hipertensi dibandingkan dengan orang normal.

Pemilihan pemeriksan TNF-α sebagai subyek penelitian karena selain diproduksi oleh makrofag, TNF-α juga

disintesis oleh sel endotel yang merupakan penyusun utama tunika intima vaskuler yang berperan dalam regulasi tekanan darah (tahanan perifer) melalui produksi zat vasoaktif salah satunya adalah Nitrit oksida (NO) (7). Jika terjadi kerusakan pada sel endotel maka TNF-α akan diekspresikan sebagai mediator proinflamasi dan transduksi sinyal antar sel. Kadar TNF-α yang diekspresikan sebanding dengan tingkat kerusakan yang ditimbulkan (5).

RT-PCR digunakan dalam penelitian ini karena teknik tersebut dapat menganalisis mRNA. mRNA yang diekspresikan oleh gen TNF-α akan diubah menjadi cDNA dengan menggunakan enzim reverse transcriptase, baru kemudian dilakukan amplifikasi PCR. Pada penelitian ini, -actin digunakan sebagai internal kontrol untuk melihat kualitas dari pemeriksaan PCR (18). -actin merupakan housekeeping gene yang diekspresikan oleh semua jenis sel dan secara umum ekspresinya tidak dipengaruhi oleh kondisi eksperimental dan selalu hadir dalam kondisi apapun (13,15).

Berdasarkan hasil yang diperoleh bahwa pada sampel orang normal dengan tekanan darah yang normal (≤ 1β0/80 mmHg) tidak menunjukkan adanya peningkatan. Hal ini sesuai teori bahwa

pada ke-adaan normal TNF-α merupakan mediator non-preformed yang hanya dilepaskan pada saat dibutuhkan seperti ketika tubuh terpapar benda asing atau adanya gangguan dalam tubuh (abnormal) (5,9).

Pada sampel hipertensi terjadi peningkatan ekspresi gen TNF-α pada tekanan darah yang tinggi yakni 150/80 – 160/90 mmHg. Hipertensi dapat terjadi karena resistensi perifer sebagai akibat disfungsi endotel atau sebaliknya. Kadar TNF-α yang tinggi (≥ 10-7 _{M) diketahui}

berperan penting terhadap resistensi perifer. Tekanan darah yang tinggi dan persisten dapat menimbulkan kerusakan berupa resistensi perifer, kadar TNF-α yang dilepaskan sebanding dengan tingkat kerusakan yang terjadi (5). Berdasarkan hal tersebut ekspresi TNF-α pada orang dengan tekanan darah tinggi (hipertensi) lebih banyak dibandingkan dengan orang dengan tekanan darah normal (normotensi) maupun rendah (hipotensi) (4,9,15).

Hal di atas belum bisa dijadikan sebagai acuan yang pasti, karena dari hasil penelitian pada sampel penderita hipertensi dengan tekanan darah yang sama (150/80 mmHg) diperoleh bahwa tidak adanya peningkatan ekpresi gen TNF-α. Sebagaimana diketahui bahwa dalam

mekanisme kerjanya, ekpresi gen TNF-α diatur dan dipengaruhi oleh multifaktorial seperti hormon (hormon steroid), molekul sinyal (cAMP) dan peptida faktor pertumbuhan termasuk sitokin IL-1 (Interleukin-1), 12 (Interleukin-12), IL-10 (Interleukin-IL-10), IFN- (Interferon- ) dan VEGF (Vasculer endothelial Growth Factor) (16). Selain itu, regulasi ekspresi TNF-α juga diinduksi oleh reseptor TNF-α sendiri. Pengikatan TNF-α dengan reseptornya (TNFR1 dan TNFR2) menimbulkan amplifikasi sinyal TNF-α. Sistem regulasi faktor-faktor tersebut mempunyai kepekaan yang berbeda pada setiap orang termasuk sistem imunitas. Sehingga meskipun berada pada keadaan tekanan darah yang sama, akan tetapi respon tubuh dapat berbeda-beda. Selain itu, tidak adanya peningkatan ekspresi gen TNF-α dapat dipengaruhi oleh antihipertensi dan antiinflamasi yang dikonsumsi penderita hipertensi.

SIMPULAN DAN SARAN

1. Simpulan

Individu dengan hipertensi terjadi peningkatan ekspresi gen TNF-α sebesar 8% dibandingkan dengan individu normal.

2. Saran

Perlu adanya penelitian untuk melihat ekspresi sitokin anti-inflamasi pada individu dengan hipertensi.

DAFTAR PUSTAKA

1. Beevers D. G. Tekanan Darah. Simbolon OH. Dian Rakyat. Jakarta. 2002. Hal 16 - 28

2. Palmer A, Williams B. Tekanan Darah Tinggi. Terjemahan oleh Yasmine E. Erlangga. Jakarta. 2005. Hal 10-59 3. Robbins, Cotran & Kumar. Dasar

Patologi Penyakit. Ed. 5. Terjemahan oleh Tjarta A, Himawan S, Kurniawan AN, Sadikin V & Halim A. Jakarta; EGC. 1999. Hal 293 – 294

4. Boos CJ & Lip HJY. Is Hypertension an Inflammatory Process. Current Pharm. Design. 2006(12). pp. 1263, 1267 -1268 5. Baratawijaya KG. Imunologi Dasar. Ed.

7. Balai Penerbit FKUI. Jakarta. 2006. Hal 124, 384 – 389

6. Putra ST. Biologi Molekuler Kedokteran. Airlangga University Press. Surabaya. 1999. Hal 165

7. The Seven Report of The Joint of National Committee. Prevention, Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure. JNC 7 Express. [diakses 9 Februari 2011]. Available

from :

www.nih.gov/guidelines/hypertension/e xpress.pdf

8. Pickering TG, Hall JE, Appel LJ, Falkner BE, Graves J, Hill MN, et al. Recommendations For Blood Pressusre

Measurement In Humans And

Experimental Animals. [diakses 9 Februari 2011]. Available from :

http://hyper.ahajournals.org/cgi/full/45/ 1/142

9. Whiteside TL. Introduction to Cytokines as Targets for Immunomodulation. In: House RV, Descotes J, editors. Cytokines in Human Health: Immunotoxicology, Pathology, and Therapeutic Applications. Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey. 2007. pp. 1-12

10. Twyman R. Gene Expression. The Human Genome. 8 Januari 2003; [dikutip 7 Februari 2010]. Available at:

http://genome.wellcome.ac.uk

11. Azhar TN. Dasar – Dasar Biologi Molekuler. Widya Padjadjaran. Bandung. 2008. Hal 52, 69-81

12. Hatta M. Advance Experimental in Medical Biology. Plenum Publisher. New York. 2003. pp 269-278. Available as PDF file

13. Boom R, Col CJA. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. Journal of Clinical Microbiology. New York. 1990 ;(28). pp 495-503. Available as PDF file 14. Yuwono T. Teori dan Aplikasi

Polymerase Chain Reaction. Penerbit Andi. Yogyakarta. 2006. hal. 10-16 15. Aust G. Competitive RT-PCR to

Quantify Small Amounts of mRNA. In: De Ley M, editor. Cytokine Protocols.

Humana Press. Totowa. 2007. pp 31-40. Available as PDF file

16. Notoatmodjo S. Metodelogi Penelitian Kesehatan. Bingkai cipta. Jakarta. 2005. Hal 92

17. Buckingham L, Flaws ML. Molecular Diagnostics. Davis Company. New York. 2007. pp. 72-77,81

18. Guiletty A, Overbergh L. An Overview of Real-Time Quantitative PCR: Applications to Quantify Cytokine Gene Expression. Ideal. [serial on the internet]. 2001[dikutip 23 Februari 2011]; Vol.25 [8 screen]. Available from: http://www.idealibrary.com

LAMPIRAN 1

DNA Manusia untuk TNF-α

>tnf-a mRna-AK314960

1 agacgctccc tcagcaagga cagcagagga ccagctaaga gggagagaag caactacaga 61 ccccccctga aaacaaccct cagacgccac

atcccctgac aagctgccag gcaggttctc 121 ttcctctcac atactgaccc acggctccac

cctctctccc ctggaaagga caccatgagc 181 actgaaagca tgatccggga cgtggagctg

gccgaggagg cgctccccaa gaagacaggg 241 gggccccagg gctccaggcg gtgcttgttc

ctcagcctct tctccttcct gatcgtggca

301 ggcgccacca cgctcttctg cctgctgcac tttggagtga tcggccccca gagggaagag 361 ttccccaggg acctctctct aatcagccct ctggc

ccagg cagtcagatc atcttctcga

421 accccgagtg acaagcctgt agcccatgtt gtagcaaacc ctcaagctga ggggcagctc 481 cagtggctga accgccgggc caatgccctc

ctggccaatg gcgtggagct gagagataac 541 cagctggtgg tgccatcaga gggcctgtac

ctcatctact cccaggtcct cttcaagggc 601 caaggctgcc cctccaccca tgtgctcctc

661 taccagacca aggtcaacct cctctctgcc atcaagagcc cctgccagag ggagacccca 721 gagggggctg aggccaagcc ctggtatgag

cccatctatc tgggaggggt cttccagctg 781 gagaagggtg accgactcag cgctgagatc

aatcggcccg actatctcga ctttgccgag 841 tctgggcagg tctactttgg gatcattgcc ctgtga Forward : cagcctcttctccttcctgat

Reverse : gccagagggctgattagaga TCTCTAATCAGCCCTCTGGC (Complementary Reverse) // > best β-actin X00351

1 ttgccgatcc gccgcccgtc cacacccgcc gccagctcac catggatgat gatatcgccg 61 cgctcgtcgt cgacaacggc tccggcatgt

gcaaggccgg cttcgcgggc gacgatgccc 121 cccgggccgt cttcccctcc atcgtggggc

gccccaggca ccagggcgtg atggtgggca 181 tgggtcagaa ggattcctat gtgggcgacg

aggcccagag caagagaggc atcctcaccc 241 tgaagtaccc catcgagcac ggcatcgtca

ccaactggga cgacatggag aaaatctggc 301 accacacctt ctacaatgag ctgcgtgtgg

ctcccgagga gcaccccgtg ctgctgaccg 361 aggcccccct gaaccccaag gccaaccgcg

agaagatgac ccagatcatg tttgagacct 421 tcaacacccc agccatgtac gttgctatcc

aggctgtgct atccctgtac gcctctggcc 481 gtaccactgg catcgtgatg gactccggtg

acggggtcac ccacactgtg cccatctacg 541 aggggtatgc cctcccccat gccatcctgc

gtctggacct ggctggccgg gacctgactg 601 actacctcat gaagatcctc accgagcgcg

gctacagctt caccaccacg gccgagcggg 661 aaatcgtgcg tgacattaag gagaagctgt

gctacgtcgc cctggacttc gagcaagaga 721 tggccacggc tgcttccagc tcctccctgg

agaagagcta cgagctgcct gacggccagg 781 tcatcaccat tggcaatgag cggttccgct

gccctgaggc actcttccag ccttccttcc 841 tgggcatgga gtcctgtggc atccacgaaa

ctaccttcaa ctccatcatg aagtgtgacg 901 tggacatccg caaagacctg tacgccaaca

cagtgctgtc tggcggcacc accatgtacc

961 ctggcattgc cgacaggatg cagaaggaga tcactgccct ggcacccagc acaatgaaga 1021 tcaagatcat tgctcctcct gagcgcaagt

actccgtgtg gatcggcggc tccatcctgg 1081 cctcgctgtc caccttccag cagatgtgga

tcagcaagca ggagtatgac gagtccggcc 1141 cctccatcgt ccaccgcaaa tgcttctagg

cggactatga cttagttgcg ttacaccctt 1201 tcttgacaaa acctaacttg cgcagaaaac

aagatgagat tggcatggct ttatttgttt 1261 tttttgtttt gttttggttt tttttttttt tttggcttga

ctcaggattt aaaaactgga

1321 acggtgaagg tgacagcagt cggttggagc gagcatcccc caaagttcac aatgtggccg 1381 aggactttga ttgcacattg ttgttttttt

aatagtcatt ccaaatatga gatgcattgt 1441 tacaggaagt cccttgccat cctaaaagcc

accccacttc tctctaagga gaatggccca 1501 gtcctctccc aagtccacac aggggaggtg

atagcattgc tttcgtgtaa attatgtaat

1561 gcaaaatttt tttaatcttc gccttaatac ttttttattt tgttttattt tgaatgatga

1621 gccttcgtgc ccccccttcc ccctttttgt cccccaactt gagatgtatg aaggcttttg 1681 gtctccctgg gagtgggtgg aggcagccag

ggcttacctg tacactgact tgagaccagt 1741 tgaataaaag tgcacacctt a

Forward : gtggggcgccccaggcacca Reverse : ctccttaatgtcacgcacgatttc GAAATCGTGCGTGACATTAAGGAG (Complementary Reverse)