Hewan Percobaan Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Nimba EEDN Hasil Identifikasi Tumbuhan Hasil Skrining Fitokimia

22

3.2 Hewan Percobaan

Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah mencit jantan dengan berat 20-30g berumur 2-3 bulan yang dikondisikan selama 2 minggu dalam kandang yang baik untuk menyesuaikan lingkungannya. 3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel 3.3.1 Pengumpulan bahan Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposive yaitu tanpa membandingkan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel yang diambil yaitu daun nimba yang masih segar dari daerah kampus jalan Abdul Hakim kecamatan Medan Baru, provinsi Sumatera Utara.

3.3.2 Identifikasi tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI.

3.3.3 Pembuatan simplisia daun nimba

Daun nimba yang telah dikumpulkan dibersihkan dari pengotoran. Selanjutnya dicuci dibawah air mengalir beberapa kali hingga bersih, kemudian ditiriskan lalu disebarkan diatas koran hingga airnya terserap, setelah itu ditimbang diperoleh daun sebanyak 3,4kg. kemudian dikeringkan dilemari pengering terlindung dari sinar matahari langsung. Setelah sampel kering ditimbang berat keringnya, diperoleh berat kering sebanyak 1,1kg. kemudian sampel yang sudah kering dihaluskan sampai menjadi serbuk dengan menggunakan blender selanjutnya dimasukkan dalam wadah plastik tertutup. Serbuk sebelum dipakai disimpan ditempat kering terlindung dari cahaya. Universitas Sumatera Utara 23

3.4 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia

Pemeriksaan karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol, kadar abu total dan kadar abu tidak larut asam Depkes, 1995.

3.4.1 Pemeriksaan makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati morfologi simplisia daun nimba dengan cara memperhatikan warna, bentuk, dan tekstur sampel.

3.4.2 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik terhadap serbuk simplisia daun nimba dilakukan dengan cara menaburkan simplisia diatas gelas preparat yang telah diteteskan dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan gelas penutup kemudian dilihat dibawah mikroskop.

3.4.3 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi destilasi toluena. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung, tabung penerima 5 ml berskala 0,05 ml, alat penampung dan pemanas listrik. Cara kerja: Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml, lalu ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Pada saat toluen mendidih, setelah itu kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air Universitas Sumatera Utara 24 terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Saat semua airterdestilasi, setelah itu dibilas bagian dalam pendingin dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992; Ditjen POM, 1995.

3.4.4 Penetapan kadar sari larut air

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling 1000ml dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara Depkes, 1995.

3.4.5 Penetapan kadar sari larut etanol

Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring, 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasarkan rata yang telah ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara Depkes, 1995. Universitas Sumatera Utara 25

3.4.6 Penetapan kadar abu otal

Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus platina atau krus silikat yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 600 o C selama 3 jam. Kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara Depkes, 1995.

3.4.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam

Abu yang telah diperoleh dalam penetapan abu didinginkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring dengan kertas masir atau kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut asam dihitung terhadap bobot yang dikeringkan diudara Depkes, 1995.

3.5 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Nimba EEDN

Pembuatan ekstrak etanol daun nimba dilakukan secara perkolasi menggunakan etanol 70. Cara kerja: sebanyak 300 g serbuk simplisia dibasahi dengan etanol 70 dan dibiarkan selama 3 jam. Kemudian dimasukkan kedalam alat perkolator, lalu dituang cairan penyari diatasnya, mulut tabung perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka dan dibiarkan tetesan ekstrak mengalir dengan kecepatan perkolat diatur 1 mlmenit, perkolat ditampung. Perkolasi dihentikan bila 500 mg perkolat terakhir diuapkan tidak lagi meninggalkan sisa. Universitas Sumatera Utara 26 Perkolat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan alat rotary evaporator pada suhu kurang lebih 60 o C sampai diperoleh ekstrak kental Ditjen POM, 1979.

3.6 Penyiapan Bahan Obat

Penyiapan sediaan meliputi penyiapan larutan putih telur ayam ras 50, penyediaan larutanTurk, penyiapan larutan buffer, penyediaan larutan Giemsa, penyiapan CMC 0,5 dan penyiapan larutan uji yaitu ekstrak etanol daun nimba EEDN dengan berbagai konsentrasi.

3.6.1 Penyiapan larutan putih telur ayam ras 50

Sebanyak 5 ml putih telur ayam ras ditambahkan dalam 5 ml salin fisiologis, kemudian dilakukan pengenceran dengan mengambil 5 ml larutan diatas lalu dicukupkan volumenya hingga 10 ml dengan larutan salin fisiologis sehingga diperoleh induk, kemudian diambil 5 ml larutan induk dan dicukupkan volumenya hingga 10 ml dengan larutan salin fisiologis sehingga diperoleh konsentrasi 50.

3.6.2 Penyediaan larutanTurk

Larutan Turk dibeli dalam bentuk sediaan kit siap untuk dipakai. Komposisinya: gentian violet 1, asam asetat glasial 2 dan akuades secukupnya.

3.6.3 Pembuatan larutan buffer

Komposisi: Na 2 HPO4 6 g, KH 2 PO 4 5 g, akuades 1000 ml. Semua bahan dilarutkan sedikit demi sedikit dengan akuades sampai larut, dicek pH nya hingga pH ±7. Sebelum digunakan larutan buffer dikocok terlebih dahulu. Universitas Sumatera Utara 27

3.6.4 Penyediaan larutanGiemsa

Larutan Giemsa dibeli dalam sediaan kit siap untuk dipakai. Komposisinya: Glycerol, Metanol, Giemsa powder. Apabila akan digunakan larutan stock dicampur larutan buffer dengan perbandingan larutan stock 1:9 larutan buffer. Larutan Giemsa berwarna biru gelap.

3.6.5 Penyiapan larutan CMC 0,5

Sebanyak 500 mg CMC ditaburkan kedalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak ±20 ml , ditutup dan dibiarkan 30 menit hingga diperoleh massa yang transparan, digerus lalu diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Anief,1999.

3.6.6 Penyiapan larutan uji suspensi EEDN

Ekstrak etanol daun nimba dibuat beragam konsentrasi yaitu konsentrasi 0,25, 0,5 dan 1. Caranya: ditimbang EEDN sebanyak 62,5 mg untuk konsentrasi 0,25, 125 mg untuk konsentrasi 0,5 dan 250 mg untuk 1, kemudian digerus dalam lumpang, lalu ditambahkan suspensi CMC 0,5 sedikit demi sedikit sambil digerus homogen lalu diencerkan dengan suspensi CMC 0,5 sampai batas tanda. 3.7 Pengujian Efektivitas Antialergi 3.7.1 Penyiapan hewan percobaan Hewan yang digunakan adalah mencit jantan sebanyak 25 ekor, dibagi menjadi 5 kelompok dimana setiap kelompok terdiri dari 5 mencit. a. Dua minggu sebelum pengujian dilakukan hewan percobaan harus dipelihara dan dirawat dengan sebaik-baiknya pada kandang yang mempunyai ventilasi baik dan selalu dijaga kebersihannya Ditjen POM, 1979. Hal ini bertujuan Universitas Sumatera Utara 28 untuk memperoleh keseragaman dalam melakukan penelitian. Mencit diberi makanan berupapelet dan akuades untuk minumannya sacara ad libitium sesukanya. Sebelum penelitian dilakukan telah diajukan ke komite etik penelitian hewan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam – Universitas Sumatera Utara Animal Research Ethics CommitteesAREC lampiran 1 halaman 54. b. Kemudian mencit ditimbang sebelum dan sesudah proses adaptasi untuk mengetahui bahwa hewan coba telah beradaptasi dengan baik.

3.7.2 Tahap pengelompokan dan perlakuan sampel

Sebelum dikelompokkan sesuai perlakuan, mencit diadaptasi selama dua minggu. Pada penelitian ini mencit terbagi menjadi 5 kelompok yaitu: K1 : tidak diberi perlakuan kelompok kontrol K2 : diberi ovalbumin tanpa diberi ekstrak K3 : diberi EEDN 0,25 dengan dosis 50 mgkg bb K4 : diberiEEDN 0,5 dengan dosis 100 mgkg bb K5 : diberi EEDN 1 dengan dosis 200 mgkg bb Semua perlakuan kecuali K1 setelah hari ke-21 dan ke-22 diberi ovalbumin secara intraperitoneal i.p sebanyak 0,5ml.

3.7.3 Pemberian EEDN pada mencit

Ekstrak etanol daun nimba diberikan pada mencit menggunakan oral sonde dengan dosis 50 mgkg bb, 100 mgkg bb dan 200 mgkg bb diberikan pada jam yang sama 09.00 WIB.

3.7.4 Pemberian ovalbumin

Pemberian ovalbumin dilakukan dengan menggunakan disposable syringe secara intraperitoneal pada mencit. Kemudian pada waktu tertentu darah diambil dari bagian ekor dengan menggunakan pipet thoma leukosit untuk dihitung jumlah Universitas Sumatera Utara 29 total leukosit dan dibuat preparat dengan menggunakan deg glass dan obyek glass untuk pemeriksaan diferensial leukosit Srikumar,et al., 2005.

3.7.5 Analisis perhitungan jumlah total sel darah putih leukosit

Perhitungan jumlah leukosit dilakukan dengan menggunakan pipet thoma leukosit. Sampel darah kapiler dihisap dengan pipet thoma sampai tanda “0,5”. Pipet kemudian dicelupkan kedalam larutan Turk dihisap sampai tanda “11” sehingga diperoleh pengenceran 1:20. Pipet dibolak balik selama kurang lebih 3 menit dengan membentuk seperempat lingkaran, kemudian 2-3 tetes darah yang pertama dibuang. Selanjutnya darah diteteskan dipinggir kamar hitung. Kamar hitung dibiarkan satu menit yang bertujuan untuk melisiskan eritrosit dan memberi kesempatan leukosit untuk menempati kamar hitung. Perhitungan leukosit dilakukan dengan bantuan mikroskop perbesaran 10 x 40 pada 4 kotak besar dari kamar hitung. Jumlah leukosit tiap ml kubik mm 3 adalah jumlah sel terhitung dikalikan dengan 50 Tambur, 2006.

3.7.6 Analisis diferensial sel darah putih leukosit

Sampel darah segar diteteskan pada obyek glass dan dibuat preparat apus dengan menggunakan tangan kanan diletakkan obyek glass lain didepan tetesan darah tersebut dengan sudut 30-40 o C. Obyek glass kedua didorong kedepan hingga membentuk apus tipis. Setelah kering preparat apus tersebut difiksasi dengan metanol selama 3 - 5 menit, biarkan mengering diudara. Preparat kemudian diwarnai dengan larutan Giemsa dengan pengenceran 1:9 selama 30 menit buffer fosfat pH ±7 . Selanjutnya preparat dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan preparat tegak lurus diatas kertas saving. Setelah kering preparat diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran10 x 40 kemudian perbesaran10 x 100 yang diberi minyak emersi. Sel yang dihitung paling sedikit 100 sel dan Universitas Sumatera Utara 30 dilakukan perhitungan persentase jenis leukosit.Angka yang diperoleh merupakan jumlah relatif masing-masing jenis leukosit dari seluruh jenis leukosit Tambur, 2006.

3.7.7 Analisis data

Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS 17 untuk menentukan homogenitas dan normalitasnya dengan uji ANAVA dua arah dan untuk mengetahui perbedaan rata-rata diantara perlakuan. Jika terdapat perbedaan, dilanjutkan dengan menggunakan uji Tukey HSD untuk mengetahui variabel mana yang memiliki perbedaan. Berdasarkan nilai signifikansi p0,05 dianggap signifikan. Universitas Sumatera Utara 31

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan

Hasil identifikasi tumbuhan yang dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor menunjukkan bahwa tumbuhan yang diteliti termasuk suku Meliaceae spesies Azadirachta indica A. Juss. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 2 halaman 55. 4.2 Hasil Karakterisasi Bahan Tumbuhan dan Serbuk Simplisia 4.2.1 Pemeriksaan makroskopik Hasil pemeriksaan makroskopik dari simplisia Lampiran 3 halaman 56 yaitu daun berwarna hijau kecoklatan, bentuk seperti bundar telur memanjang, tepi daun bergerigi kasar, daun menyirip, tidak simetris, panjang helaian daun 5 cm sampai 7 cm, lebar 3 cm sampai 4 cm, ujung daun meruncing, rasa pahit.

4.2.2 Pemeriksaan mikroskopik

Hasil pemeriksaan mikroskopik dari penampak melintang daun nimbi dijumpai adanya epidermis atas satu lapis sel, epidermis bawah satu lapis sel, rambut penutup agak menggelombang ujung runcing, jaringan palisade 2 lapis sel, didalam palisade terdapat hablur kalsium oksalat bentuk roset, terkadang didalam sel terdapat beberapa hablur, jaringan bunga karang terdapat beberapa lapis sel didalam jaringan bunga karang terdapat hablur kalsium oksalat bentuk roset. Berkas pembuluh tipe bikolateral, stomata tipe anomositik. Pengamatan daun segar dan serbuk simplisia menggunakan mikroskopik dapat dilihat pada Gambar 4.1 dan Gambar 4.2. Universitas Sumatera Utara 32 1 7 2 8 3 9 4 10 5 11 6 12 Gambar 4.1 Gambar mikroskopik melintang daun nimba segar Keterangan : 1 = dinding kutikula 7 = hablur kalsium oksalat 2 = epidermis atas 8 = xilem 3 = palisade 9 = floem 4 = jaringan bunga karang 10 = epidermis bawah 5 = ruang sekresi 11 = kolenkim 6 = serabut 12 = rambut penutup 1 2 3 4 5 6 Gambar 4.2 Gambar mikroskopik serbuk simplisia daun nimba Keterangan : 1= rambut penutup 4 = epidermis bawah dengan stomata 2 = hablur kalsium oksalat 5 =berkas pembuluh 3 = mesofil dengan palisade 6 = epidermis atas Universitas Sumatera Utara 33

4.2.3 Pemeriksaan karakterisasi serbuk simplisia

Hasil pemeriksaan karakterisasi simplisia daun nimba dapat dilihat pada Tabel 4.1 Tabel 4.1 Hasil karakterisasi simplisia dari daun nimba No Parameter Hasil Persyaratan MMI 1 Kadar air 7,33 Tidak lebih 10 2 Kadar sari larut dalam air 23,24 Tidak kurang 23 3 Kadar sari larut dalam etanol 9,58 Tidak kurang 9 4 Kadar abu total 5,17 Tidak lebih 7 5 Kadar abu tidak larut dalam asam 0,43 Tidak lebih 0,5 Perhitungan hasil pemeriksaan karakterisasi simplisia dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 58. Hasil pemeriksaan karakterisasi simplisia yaitu kadar air, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol, kadar abu total, kadar abu tidak larut asam memenuhi syarat yang telah tercantum dalam Materia Medika Indonesia.

4.3 Hasil Skrining Fitokimia

Hasil skrining fitokimia terhadap daun nimba dapat diketahui bahwa daun nimba mengandung senyawa-senyawa kimia seperti yang terlihat pada Tabel 4.2 Tabel 4.2 Hasil skrining fitokimia dari simplisia daun nimba No Nama Senyawa Hasil 1. Alkaloid - 2. Flavonoid + 3. SteroidTriterpenoid + 4. Tanin + 5. Glikosida + 6. Saponin + Keterangan: + = Positif - = Negatif Menurut Rafidah 1999, Hasil pemeriksaan skrining fitokimia menunjukkan bahwa flavonoida, tanin, glikosida, steroidtriterpenoid dan saponin terdapat pada serbuk simplisia daun nimba. Universitas Sumatera Utara 34 4.4 Hasil Pengujian Antialergi 4.4.1 Jumlah total sel darah putih leukosit mencit