Jenis dan Rancangan Penelitian Analisis Hasil Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dan bersifat eksploratif deskriptif. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas : Senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult ® . b. Variabel tergantung : Diameter zona hambat yang terbentuk. c. Variabel pengacau terkendali : Media penanaman dan identifikasi isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult ® yaitu MRS de Man Rogosa Sharpe, media penanaman dan identifikasi Escherichia coli dan Enterococcus faecalis yaitu Nutrien Agar dan Nutrien Broth, suhu inkubasi 37 °C, waktu inkubasi 24 jam, kepadatan suspensi bakteri uji setara dengan larutan standar Mac Farland II 6 x 10 8 CFUml, diameter paper disc 6 mm, volume suspensi bakteri uji 1 ml, volume senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult ® yang diujikan pada bakteri uji E. coli dan E. faecalis 10 ml. 22 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2. Definisi operasional

a. Potensi antibakteri adalah kemampuan senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult ® dalam menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri uji E. coli dan E. faecalis dengan menunjukkan diameter zona hambat yang lebih besar daripada diameter zona hambat kontrol negatif b. Yakult ® adalah suatu produk susu fermentasi yang mengandung bakteri asam laktat, sukrosa dan susu skim. Konsistensinya berbentuk cair dan dikemas di dalam botol plastik bervolume 75 ml. Produk ini berasal dari Jepang dan telah diproduksi dan dipasarkan di banyak negara termasuk Indonesia. c. Escherichia coli ATCC 25922 diperoleh dari Balai Kesehatan Departemen Kesehatan Yogyakarta. d. Enterococcus faecalis ATCC 33816 diperoleh dari Balai Kesehatan Departemen Kesehatan Yogyakarta. e. Senyawa antibakteri adalah senyawa yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri uji E. coli dan E. faecalis. f. Zona hambat adalah zona jernih bakteri uji yaitu E. coli dan E. faecalis di sekitar paper disc yang telah diinokulasi senyawa yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat. g. Media MRS de Man Rogosa Sharpe Oxoid adalah media untuk memacu pertumbuhan dan mengidentifikasi bakteri asam laktat yaitu bakteri yang menghasilkan produk akhir berupa asam laktat dari hasil metabolisme karbohidrat secara fermentasi.

C. Bahan dan Alat 1. Bahan penelitian

a. Yakult ® produksi PT Yakult Indonesia Persada Sukabumi, b. Media pertumbuhan dan identifikasi isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult ® adalah MRS de Man Rogosa Sharpe Oxoid dengan komposisi gl : peptone 10; “lab-lemco” powder 8; yeast extract 4; glucose 20; sorbitan monooleate 1 ml; dipotassium hydrogen phosphate 2; sodium acetate 3H 2 O 5; triammonium citrate 2; magnesium sulphate 7H 2 O 0,2; manganese sulphate 4H 2 O 0,05. c. Biakan murni bakteri uji : Escherichia coli dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi USD dan Enterococcus faecalis ATCC 33816 dari Balai Kesehatan Yogyakarta. d. Media pertumbuhan dan identifikasi biakan murni bakteri uji adalah NA Nutrient Agar Oxoid dengan takaran 28 gL dengan komposisi gl : “lab- lemco” powder 1; yeast extract 2; peptone 10; sodium chloride 5; agar 15 dan NB Nutrient Broth dengan takaran 37 gL dengan komposisi gl : “lab- lemco” powder 1; yeast extract 2; peptone 10; sodium chloride 5. e. Bahan untuk uji identifikasi morfologi sel : 1 Gerakan bakteri metode tusukan : media agar semi solid 0,2-0,4 agar 2 Pengecatan a Pengecatan gram : kristal violet gram A, iodine gram B, alcohol 96 gram C, safranin gram D b Pengecatan acid fast : Ziehl Neelson carbolfuchsin, methylen blue, alcohol 96 , c Pengecatan spora : malachite green 5, safranin f. Bahan untuk uji identifikasi morfologi koloni: 1 Medium Cair : MRS de Man Rogosa Sharpe Broth Oxoid 2 Medium Agar : MRS de Man Rogosa Sharpe Agar Oxoid g. Bahan untuk tes biokimia : 1 Uji oksidase : reagens tetramethyl-paraphenyldiamine 2 Uji katalase : reagens hidrogen peroksida 3 Uji fermentasi karbohidrat : medium O-F Difco 4 Uji sitrat : medium Simmon’s citrate Difco 5 Uji dekarboksilase lisin : medium LIA Lysin Iron Agar Oxoid 6 Uji hidrolisis gelatin : Nutrient Broth Oxoid dan 12 gelatin 7 Uji hidrogen sulfida : medium TSIA Triple Sugar Iron Agar Oxoid 8 Uji indol : medium triptone water dengan reagen Kovac 9 Uji MRVP : medium MR-VP Methyl Red – Voges Proskauer Oxoid, methyl red, larutan nafto 5 dan KOH 40 h. Larutan standar Mc Farland II 6 x 10 8 CFUml i. Aquadest steril j. Kontrol positif : Penicillin paper disc k. Kontrol negatif : Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri l. Paper disc steril berdiameter 6 mm PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2. Alat penelitian

Autoklaf ALP Co.Ltd, Microbiological Safety Cabinet, Centrifuge Heraust Christ, Filter bakteri 0,2 μm Millipore, Jangka sorong, Mikropipet Nichiryo 5000 DG, Inkubator WTB Binder, Memert, Oven WTC Binder, Mikroskop cahaya Olympus Type CH 30, Shaker Stuart Scientific, Jarum ose, Jarum inokulasi, Alat-alat gelas Pyrex.

D. Tata Cara Penelitian 1. Isolasi Bakteri

dalam Susu Fermentasi Yakult ® dengan Metode Streak Plate Isolasi bakteri dari susu fermentasi Yakult ® dilakukan dengan metode streak plate. Satu ose Yakult ® digoreskan pada permukaan agar dalam cawan petri. Setelah itu cawan petri diinkubasi terbalik selama 2 hari pada suhu 37 ° C. Setelah inkubasi, akan terlihat koloni yang terpisah-pisah. Tiap koloni diharapkan berasal dari satu sel bakteri dan terdiri dari satu spesies bakteri. Hasil isolasi akan digunakan untuk tahap penelitian berikutnya.

2. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult

® Bakteri dari susu fermentasi Yakult ® diidentifikasi dengan pengamatan morfologi sel, morfologi koloni dan uji biokimia. a. Pengamatan morfologi sel meliputi pergerakan bakteri dengan metode tusukan, dan pengecatan bakteri yaitu pengecatan gram, pengecatan acid fast, pengecatan spora, dan pengecatan dinding sel. 1 Pergerakan bakteri : Metode Tusukan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Biakan bakteri diinokulasikan pada media agar semi solid 0,2-0,4 agar yang telah steril dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 48 jam. 2 Pengecatan bakteri a Pengecatan gram Membuat pulasan isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult ® di atas obyek gelas, lalu difiksasi dengan api. Pulasan tersebut ditetesi kristal violet dan didiamkan selama 1 menit. Setelah itu dicuci dengan air mengalir untuk membuang sisa cat. Larutan iodin diteteskan ke atas pulasan tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan ditambahkan alkohol sebagai larutan peluntur. Pulasan tersebut dicuci dengan air mengalir lagi dan diberi larutan safranin. Langkah berikutnya pulasan yang telah diberi safranin tersebut dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan mengering. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X menggunakan minyak emersi. Pada pengamatan sifat gram, apabila warna sel adalah violet, menunjukkan bahwa bakteri tersebut termasuk bakteri gram positif. Namun, sebaliknya bila warna merah yang terjadi, berarti bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif. b Pengecatan acid fast Membuat pulasan isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult ® di atas obyek gelas dan memfiksasinya di atas pembakar spiritus. Kemudian ditutup dengan sepotong kertas filter, lalu larutan carbolfuchsin PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ditambahkan di atasnya. Setelah itu, dipanaskan di atas api spiritus dengan nyala kecil dan didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit, obyek gelas didinginkan, dicuci dengan air mengalir dan diangin- anginkan. Dicuci dengan alkohol 96 sambil digoyang-goyangkan sampai seluruhnya tidak tampak. Sesudah itu, dicuci dengan air mengalir dan diangin-anginkan. Methylen biru dibubuhkan di atas obyek gelas dan didiamkan selama 20-30 detik. Dicuci, dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat sampai 1000X menggunakan minyak emersi. Bakteri yang bersifat acid fast tampak berwarna merah, sedangkan yang non acid fast berwarna biru. c Pengecatan spora Pulasan isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult ® dibuat di atas obyek gelas dan difiksasi dengan api. Setelah itu, malachite green diteteskan ke atas pulasan tersebut dan dipanaskan kembali selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan diberi cat safranin selama 30-40 detik. Berikutnya dicuci dengan air mengalir kembali dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X. Sel vegetatif berwarna merah dan spora berwarna hijau. b. Pengamatan morfologi koloni. 1 Penanaman pada medium MRS agar tegak Medium MRS agar tegak diinokulasi secara aseptik dengan biakan bakteri menggunakan jarum inokulasi secara tusukan sampai ke dasar tabung. Kemudian diinkubasi pada temperatur 37 ° C selama 48 jam. Setelah PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI itu, dilakukan pengamatan pertumbuhan pada bagian permukaan dan bagian dasar, juga bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan. 2 Penanaman pada medium MRS agar miring Medium MRS agar miring diinokulasi secara aseptik dengan biakan bakteri menggunakan jarum inokulasi secara goresan lurus. Lalu diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 ° C. Yang diamati adalah pertumbuhannya, bentuk pertumbuhan pada bekas goresan, elevasi, topografi, warna chromogenesis, bau, konsistensi dan warna medium. 3 Penanaman pada medium MRS cair Medium MRS cair diinokulasi secara aseptik dengan biakan bakteri menggunakan ose. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 ° C selama 48 jam. Pengamatannya meliputi : pertumbuhan pada permukaan, kekeruhan, bau dan endapan. 4 Penanaman pada medium MRS agar Medium MRS agar pada cawan petri diinokulasi secara goresan dengan biakan bakteri menggunakan jarum ose. Sesudah itu, diinkubasi selama 48 jam pada temperatur 37 ° C selama 48 jam. Pertumbuhan, bentuk koloni, permukaan, elevasi, bentuk tepi dan struktur dalamnya akan diamati setelah terbentuk koloni pada permukaan agar cawan petri. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI c. Uji biokimia 1 Uji katalase Satu atau dua ose isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult ® diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi media Nutrien Broth sebanyak 5 ml lalu H 2 O 2 3 diteteskan ke dalamnya. Bila terbentuk gelembung gas O 2 berarti katalase positif, sedangkan sebaliknya bila tidak ada gelembung atau buih berarti katalase negatif. 2 Uji oksidase Larutan tetramethyl-paraphenyldiamine diteteskan pada kertas saring. Satu ose dari kultur bakteri diletakkan pada kertas saring tersebut, kemudian diamati hasilnya. Reaksi positif terjadi apabila timbul perubahan warna menjadi ungu tua setelah didiamkan selama 10 menit. Hal ini berarti bakteri tersebut memiliki enzim oksidase sitokrom. Sebaliknya bila tidak terjadi perubahan warna, berarti sebagai reaksi negatif. 3 Uji oksidasi fermentasi O-F Medium O-F yang mengandung glukosa diisikan ke dalam 4 tabung reaksi. Dua di antaranya diinokulasi dengan kultur isolat bakteri umur 24 jam menggunakan jarum inokulasi secara tusukan. Sedangkan dua yang lain berfungsi sebagai kontrol tanpa inokulasi isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult ® Salah satu dari 2 tabung yang sudah diinokulasi tersebut ditetesi parafin, sedangkan yang lain tidak. Lalu keempat tabung itu diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 48 jam. Setelah 48 jam, hasilnya diamati dengan melihat perubahan warna pada medium O-F. Warna asal medium O-F adalah hijau dan bila medium yang ditutupi parafin berubah warna menjadi kuning berarti bakteri tersebut memetabolisme karbohidrat secara fermentatif, sedangkan untuk yang tidak ditutupi parafin bila mediumnya berubah warna menjadi kuning berarti bakteri dapat memetabolisme karbohidrat secara oksidatif 4 Uji sitrat Satu tabung medium Simmon’s citrate yang berbentuk agar miring diinokulasi dengan satu ose kultur bakteri secara goresan. Untuk kontrol disiapkan juga satu tabung medium Simmon’s citrate tanpa inokulasi bakteri. Kemudian keduanya diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 48 jam. Hasil yang diperoleh bila terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan bahwa bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. 5 Uji dekarboksilase lisin Tabung berisi medium LIA Lysin Iron Agar diinokulasi dengan kultur isolat bakteri secara tusukan dan juga dibuat kontrol medium Lysin Iron Agar tanpa inokulasi bakteri dibuat juga sebagai pembanding. Setelah itu, kedua tabung diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24 jam dan 48 jam. Bila terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning pada umur 24 jam dan setelah 48 jam berwarna ungu kembali, berarti reaksi tersebut positf. Perubahan warna menjadi kuning menandakan bahwa bakteri melakukan fermentasi dan berwarna ungu kembali berarti lisin mengalami dekarboksilasi. 6 Uji hidrolisis gelatin Kultur bakteri diinokulasikan secara tusukan pada media dengan komposisi nutrient broth 13 gL, gelatin 12 dan agar 0,3 . Kontrol yang berisi medium tanpa inokulasi bakteri juga dibuat untuk pembanding. Lalu diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37 ° C. Pada saat pengamatan, tabung dimasukkan ke dalam lemari es selama 30 menit. Terjadinya pencairan gelatin dibandingkan dengan kontrol membuktikan bahwa bakteri mampu menghasilkan eksoenzim gelatinase. 7 Uji pembentukan H 2 S Kultur isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult ® diinokulasikan ke dalam medium TSIA Triple Sugar Iron Agar miring secara goresan dan tusukan. Untuk kontrol adalah medium TSIA tanpa inokulasi bakteri. Empat puluh delapan jam dan 37 ° C sebagai waktu dan suhu inkubasi uji tersebut. Terbentuknya endapan hitam pada bekas inokulasi menunjukkan bahwa bakteri mampu menghasilkan senyawa desulfurase. Bila bagian slant berwarna kuning dan butt berwarna merah, menunjukkan bahwa glukosa difermentasikan, sedangkan bila seluruh medium slant dan butt berwarna kuning, maka artinya laktosa atau sukrosa atau keduanya difermentasikan. Kalau ada pembentukan gas pada bagian butt dan medium kadangkala terpecah, berarti ada pembentukan gas H 2 dan CO 2 . Sebaliknya, apabila glukosa, laktosa dan sukrosa tidak difermentasikan, pada bagian slant dan butt akan berwarna merah. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 8 Uji pembentukan indol Satu ose kultur bakteri diinokulasikan ke dalam satu tabung medium tripton water dan kemudian diinkubasi selama 48 jam dan suhu 37 ° C. Satu tabung medium pepton water yang lain digunakan untuk kontrol tanpa inokulasi bakteri. Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 37 ° C. Reagen Kovac ditambahkan ke dalamnya setelah inkubasi. Bila terbentuk cincin merah yang tidak larut pada permukaan medium maka itu berarti hasilnya positif. Reaksi ini menunjukkan bahwa bakteri mampu menghasilkan enzim triptofanase yang bisa mengkatalisasi penguraian gugus indol dari triptofan sehingga indol akan menumpuk dalam medium biakan sebagai produk buangan. 9 Uji MR-VP Methyl Red-Voges Proskauer Kultur isolat bakteri diinokulasi dengan jarum inokulasi pada dua tabung yang berisi medium MR-VP. Dua tabung berisi medium yang sama untuk kontrol. Lalu diinkubasi selama 48 jam dan pada temperatur 37 ° C. Kemudian ditambah reagen methyl red pada dua tabung medium MR-VP yang satu kontrol, sedangkan dua tabung yang lain satunya kontrol ditambah 40 KOH dan 5 larutan α-naphtol. Hasil yang terjadi bila ada perubahan warna menjadi kuning pada uji MR, bakteri tersebut tidak dapat memfermentasikan glukosa. Sebaliknya bila tetap berwarna merah, terjadi fermentasi glukosa. Sedangkan bila ada perubahan warna menjadi merah muda pada uji VR, menandakan bahwa bakteri mampu memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3 butanadiol.

3. Isolasi Senyawa yang Dihasilkan oleh Bakteri dalam Susu Fermentasi

Yakult ® Beberapa ose kultur isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult ® diinokulasi ke dalam medium MRS cair sebanyak 100 ml di dalam erlenmeyer. Lalu diinkubasi selama 3-4 hari pada suhu 37 ° C dan dilakukan penggojogan berkecepatan 170 rpm di dalam shaker inkubator. Setelah itu disentrifugasi menggunakan sentrifuge yang berkecepatan 5000 rpm selama 1 jam supaya ada pemisahan senyawa penghambat dari biomassa sel yang mengendap. Supernatan disterilisasi dengan filter bakteri steril diameter 0,2 μm sehingga diperoleh metabolit sekunder yang dihasilkan Lactobacillus sp.

4. Pengujian Potensi Senyawa yang Dihasilkan oleh Bakteri dalam Susu

Fermentasi Yakult ® terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis dengan Metode Difusi Menggunakan Paper Disc a. Pembuatan suspensi bakteri uji Bakteri uji diinokulasikan pada medium NB Nutrient Broth dan diinkubasi selama 1-2 hari. Setelah itu, bakteri uji yang tumbuh di medium NB tersebut disuspensikan ke dalam Nutrient Broth steril sampai kekeruhannya setara dengan larutan standard Mac Farland II 6 x 10 8 CFUml. b. Pembiakan bakteri uji secara pour plate. Nutrien agar steril yang bersuhu 40-50°C masing-masing diinokulasi dengan 1 ml suspensi bakteri uji Escherichia coli dan Enterococcus faecalis umur 24 jam. Kemudian media yang berisi biakan tersebut dituang ke dalam cawan petri steril digoyang sampai homogen dan dibiarkan memadat. c. Pengujian potensi antibakteri dengan metode difusi menggunakan paper disc. Supernatan disiapkan sebanyak 10 ml yang diperoleh pada tahap 3 di dalam tabung reaksi steril. Kemudian paper disc diambil dengan pinset steril dan dicelupkan selama 10 detik ke dalam supernatan tersebut. Paper disc tersebut dikeringanginkan pada gelas arloji steril untuk menghilangkan ekses air selama 1-2 jam. Paper disc ditempatkan di permukaan medium agar yang telah mengandung bakteri uji Escherichia coli dan Enterococcus faecalis. Setelah itu, diinkubasi selama 1-2 hari atau sampai terbentuknya zona jernih di sekitar paper disc pada suhu 37 º C. Perlakuan ini dibuat agar senyawa antibakteri mempunyai waktu untuk berdifusi ke dalam agar yang telah diinokulasi bakteri uji Escherichia coli dan Enterococcus faecalis. Setelah itu diameter zona jernih yang terbentuk di sekitar paper disc diukur dengan penggaris.

E. Analisis Hasil

Data uji potensi antibakteri oleh senyawa yang dihasilkan oleh bakteri diperoleh dengan mengukur diameter zona hambat yang terbentuk di sekitar paper disc dengan menggunakan penggaris. Selain itu juga mengidentifikasi bakteri dalam susu fermentasi Yakult ® dengan pengamatan morfologi sel, morfologi koloni, dan uji sifat biokimia. Data identifikasi dicocokkan dengan panduan determinasi bakteri Holt et al, 2000. Hasil pengamatan uji potensi dan identifikasi bakteri dalam susu fermentasi Yakult ® dideskripsikan dengan foto dan gambar mikrofotografi. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult

® dengan Metode Streak Plate Isolasi bakteri berguna untuk memisahkan bakteri dari lingkungannya dan untuk dapat mempelajari sifat biakan, morfologi dan sifat faalinya. Teknik isolasi bakteri yaitu teknik penggoresan agar streak plate, teknik agar tuang pour plate dan teknik agar sebar spread plate Lay, 1994. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode streak plate yang merupakan teknik penggoresan agar. Dasar metode streak plate adalah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan medium agar yang sesuai dalam petridish. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni yang terpisah yang mungkin berasal dari satu sel bakteri sehingga dapat diisolasi lebih lanjut Jutono dkk, 1980. Satu ose Yakult ® digoreskan pada permukaan agar dalam cawan petri. Setelah itu cawan petri diinkubasi terbalik selama 48 jam pada suhu 37 ° C. Setelah inkubasi akan terlihat koloni yang terpisah-pisah yang merupakan biakan murni. Biakan murni adalah bakteri yang terdiri dari satu spesies dan berasal dari perbanyakan satu sel bakteri Jutono dkk, 1980. Hasil isolasi akan digunakan untuk tahap penelitian berikutnya. Media yang digunakan untuk isolasi bakteri asam laktat dalam susu fermentasi Yakult ® adalah media MRS de Man Rogosa Sharpe karena media ini digunakan untuk pertumbuhan dan identifikasi bakteri asam laktat yang diduga terdapat dalam susu fermentasi Yakult ® . MRS Oxoid mempunyai komposisi gl 36 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI sebagai berikut : peptone 10; “lab-lemco” powder 8; yeast extract 4; glucose 20; sorbitan monooleate 1 ml; dipotassium hydrogen phosphate 2; sodium acetate 3H 2 O 5; triammonium citrate 2; magnesium sulphate 7H 2 O 0,2; manganese sulphate 4H 2 O 0,05 lampiran 1. Dari komposisinya, media MRS merupakan media yang diperkaya. Menurut Jutono dkk 1980, media yang diperkaya adalah media yang ditambah zat-zat tertentu sehingga dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba heterotrof memperoleh makanan dan energi dari sumber organik tertentu. Media merupakan nutrien yang dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba. Pada susu fermentasi Yakult ® , media yang digunakan adalah susu dengan komposisi sbb: air sekitar 87 , casein protein 2,5 , laktosa karbohidrat 5 , lemak 4 , sisanya lactalbumin dan garam elektrolit Alcamo, 1997. Pada penelitian ini menggunakan media MRS karena media ini mempunyai komponen yang menyerupai komponen susu seperti protein pepton, karbohidrat glukosa dan lemak lab-lemco powder. Oleh karena itu bakteri dalam susu fermentasi Yakult ® dapat tumbuh, diisolasi dan menghasilkan senyawa sebagai hasil fermentasi dengan menggunakan media MRS. Pada permukaan media MRS Agar, digoreskan satu ose Yakult ® kemudian diinkubasi terbalik selama 48 jam pada suhu 37 ° C. Waktu inkubasi 48 jam dipilih karena waktu tersebut cukup bagi bakteri untuk tumbuh dan membentuk koloni. Suhu 37 ° C ditetapkan karena bakteri tersebut berhabitat dalam tubuh manusia di dalam usus maka bakteri itu termasuk bakteri mesofil yang mempunyai suhu optimal pertumbuhan yang mendekati suhu tubuh manusia. Hal ini dapat PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI meningkatkan pertumbuhan mikroba secara maksimal sehingga dengan cepat akan terbentuk koloni pada permukaan agar di cawan petri. Setelah diinkubasi 48 jam, tumbuh koloni-koloni mikroba yang terbentuk sepanjang goresan pada permukaan agar Lampiran 2. Koloni hasil streak plate berbentuk circular bulat, permukaannya licin, elevasinya convex cembung, bentuk tepinya entire rata, warnanya putih. Isolat bakteri ini akan digunakan untuk identifikasi dan determinasi serta pengujian potensi antibakterinya terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis.

B. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult