Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult

2. Alat penelitian

Autoklaf ALP Co.Ltd, Microbiological Safety Cabinet, Centrifuge Heraust Christ, Filter bakteri 0,2 μm Millipore, Jangka sorong, Mikropipet Nichiryo 5000 DG, Inkubator WTB Binder, Memert, Oven WTC Binder, Mikroskop cahaya Olympus Type CH 30, Shaker Stuart Scientific, Jarum ose, Jarum inokulasi, Alat-alat gelas Pyrex.

D. Tata Cara Penelitian 1. Isolasi Bakteri

dalam Susu Fermentasi Yakult ® dengan Metode Streak Plate Isolasi bakteri dari susu fermentasi Yakult ® dilakukan dengan metode streak plate. Satu ose Yakult ® digoreskan pada permukaan agar dalam cawan petri. Setelah itu cawan petri diinkubasi terbalik selama 2 hari pada suhu 37 ° C. Setelah inkubasi, akan terlihat koloni yang terpisah-pisah. Tiap koloni diharapkan berasal dari satu sel bakteri dan terdiri dari satu spesies bakteri. Hasil isolasi akan digunakan untuk tahap penelitian berikutnya.

2. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult

® Bakteri dari susu fermentasi Yakult ® diidentifikasi dengan pengamatan morfologi sel, morfologi koloni dan uji biokimia. a. Pengamatan morfologi sel meliputi pergerakan bakteri dengan metode tusukan, dan pengecatan bakteri yaitu pengecatan gram, pengecatan acid fast, pengecatan spora, dan pengecatan dinding sel. 1 Pergerakan bakteri : Metode Tusukan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Biakan bakteri diinokulasikan pada media agar semi solid 0,2-0,4 agar yang telah steril dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 48 jam. 2 Pengecatan bakteri a Pengecatan gram Membuat pulasan isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult ® di atas obyek gelas, lalu difiksasi dengan api. Pulasan tersebut ditetesi kristal violet dan didiamkan selama 1 menit. Setelah itu dicuci dengan air mengalir untuk membuang sisa cat. Larutan iodin diteteskan ke atas pulasan tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan ditambahkan alkohol sebagai larutan peluntur. Pulasan tersebut dicuci dengan air mengalir lagi dan diberi larutan safranin. Langkah berikutnya pulasan yang telah diberi safranin tersebut dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan mengering. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X menggunakan minyak emersi. Pada pengamatan sifat gram, apabila warna sel adalah violet, menunjukkan bahwa bakteri tersebut termasuk bakteri gram positif. Namun, sebaliknya bila warna merah yang terjadi, berarti bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif. b Pengecatan acid fast Membuat pulasan isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult ® di atas obyek gelas dan memfiksasinya di atas pembakar spiritus. Kemudian ditutup dengan sepotong kertas filter, lalu larutan carbolfuchsin PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ditambahkan di atasnya. Setelah itu, dipanaskan di atas api spiritus dengan nyala kecil dan didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit, obyek gelas didinginkan, dicuci dengan air mengalir dan diangin- anginkan. Dicuci dengan alkohol 96 sambil digoyang-goyangkan sampai seluruhnya tidak tampak. Sesudah itu, dicuci dengan air mengalir dan diangin-anginkan. Methylen biru dibubuhkan di atas obyek gelas dan didiamkan selama 20-30 detik. Dicuci, dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat sampai 1000X menggunakan minyak emersi. Bakteri yang bersifat acid fast tampak berwarna merah, sedangkan yang non acid fast berwarna biru. c Pengecatan spora Pulasan isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult ® dibuat di atas obyek gelas dan difiksasi dengan api. Setelah itu, malachite green diteteskan ke atas pulasan tersebut dan dipanaskan kembali selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan diberi cat safranin selama 30-40 detik. Berikutnya dicuci dengan air mengalir kembali dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X. Sel vegetatif berwarna merah dan spora berwarna hijau. b. Pengamatan morfologi koloni. 1 Penanaman pada medium MRS agar tegak Medium MRS agar tegak diinokulasi secara aseptik dengan biakan bakteri menggunakan jarum inokulasi secara tusukan sampai ke dasar tabung. Kemudian diinkubasi pada temperatur 37 ° C selama 48 jam. Setelah PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI itu, dilakukan pengamatan pertumbuhan pada bagian permukaan dan bagian dasar, juga bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan. 2 Penanaman pada medium MRS agar miring Medium MRS agar miring diinokulasi secara aseptik dengan biakan bakteri menggunakan jarum inokulasi secara goresan lurus. Lalu diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 ° C. Yang diamati adalah pertumbuhannya, bentuk pertumbuhan pada bekas goresan, elevasi, topografi, warna chromogenesis, bau, konsistensi dan warna medium. 3 Penanaman pada medium MRS cair Medium MRS cair diinokulasi secara aseptik dengan biakan bakteri menggunakan ose. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 ° C selama 48 jam. Pengamatannya meliputi : pertumbuhan pada permukaan, kekeruhan, bau dan endapan. 4 Penanaman pada medium MRS agar Medium MRS agar pada cawan petri diinokulasi secara goresan dengan biakan bakteri menggunakan jarum ose. Sesudah itu, diinkubasi selama 48 jam pada temperatur 37 ° C selama 48 jam. Pertumbuhan, bentuk koloni, permukaan, elevasi, bentuk tepi dan struktur dalamnya akan diamati setelah terbentuk koloni pada permukaan agar cawan petri. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI c. Uji biokimia 1 Uji katalase Satu atau dua ose isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult ® diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi media Nutrien Broth sebanyak 5 ml lalu H 2 O 2 3 diteteskan ke dalamnya. Bila terbentuk gelembung gas O 2 berarti katalase positif, sedangkan sebaliknya bila tidak ada gelembung atau buih berarti katalase negatif. 2 Uji oksidase Larutan tetramethyl-paraphenyldiamine diteteskan pada kertas saring. Satu ose dari kultur bakteri diletakkan pada kertas saring tersebut, kemudian diamati hasilnya. Reaksi positif terjadi apabila timbul perubahan warna menjadi ungu tua setelah didiamkan selama 10 menit. Hal ini berarti bakteri tersebut memiliki enzim oksidase sitokrom. Sebaliknya bila tidak terjadi perubahan warna, berarti sebagai reaksi negatif. 3 Uji oksidasi fermentasi O-F Medium O-F yang mengandung glukosa diisikan ke dalam 4 tabung reaksi. Dua di antaranya diinokulasi dengan kultur isolat bakteri umur 24 jam menggunakan jarum inokulasi secara tusukan. Sedangkan dua yang lain berfungsi sebagai kontrol tanpa inokulasi isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult ® Salah satu dari 2 tabung yang sudah diinokulasi tersebut ditetesi parafin, sedangkan yang lain tidak. Lalu keempat tabung itu diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 48 jam. Setelah 48 jam, hasilnya diamati dengan melihat perubahan warna pada medium O-F. Warna asal medium O-F adalah hijau dan bila medium yang ditutupi parafin berubah warna menjadi kuning berarti bakteri tersebut memetabolisme karbohidrat secara fermentatif, sedangkan untuk yang tidak ditutupi parafin bila mediumnya berubah warna menjadi kuning berarti bakteri dapat memetabolisme karbohidrat secara oksidatif 4 Uji sitrat Satu tabung medium Simmon’s citrate yang berbentuk agar miring diinokulasi dengan satu ose kultur bakteri secara goresan. Untuk kontrol disiapkan juga satu tabung medium Simmon’s citrate tanpa inokulasi bakteri. Kemudian keduanya diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 48 jam. Hasil yang diperoleh bila terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan bahwa bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. 5 Uji dekarboksilase lisin Tabung berisi medium LIA Lysin Iron Agar diinokulasi dengan kultur isolat bakteri secara tusukan dan juga dibuat kontrol medium Lysin Iron Agar tanpa inokulasi bakteri dibuat juga sebagai pembanding. Setelah itu, kedua tabung diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24 jam dan 48 jam. Bila terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning pada umur 24 jam dan setelah 48 jam berwarna ungu kembali, berarti reaksi tersebut positf. Perubahan warna menjadi kuning menandakan bahwa bakteri melakukan fermentasi dan berwarna ungu kembali berarti lisin mengalami dekarboksilasi. 6 Uji hidrolisis gelatin Kultur bakteri diinokulasikan secara tusukan pada media dengan komposisi nutrient broth 13 gL, gelatin 12 dan agar 0,3 . Kontrol yang berisi medium tanpa inokulasi bakteri juga dibuat untuk pembanding. Lalu diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37 ° C. Pada saat pengamatan, tabung dimasukkan ke dalam lemari es selama 30 menit. Terjadinya pencairan gelatin dibandingkan dengan kontrol membuktikan bahwa bakteri mampu menghasilkan eksoenzim gelatinase. 7 Uji pembentukan H 2 S Kultur isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult ® diinokulasikan ke dalam medium TSIA Triple Sugar Iron Agar miring secara goresan dan tusukan. Untuk kontrol adalah medium TSIA tanpa inokulasi bakteri. Empat puluh delapan jam dan 37 ° C sebagai waktu dan suhu inkubasi uji tersebut. Terbentuknya endapan hitam pada bekas inokulasi menunjukkan bahwa bakteri mampu menghasilkan senyawa desulfurase. Bila bagian slant berwarna kuning dan butt berwarna merah, menunjukkan bahwa glukosa difermentasikan, sedangkan bila seluruh medium slant dan butt berwarna kuning, maka artinya laktosa atau sukrosa atau keduanya difermentasikan. Kalau ada pembentukan gas pada bagian butt dan medium kadangkala terpecah, berarti ada pembentukan gas H 2 dan CO 2 . Sebaliknya, apabila glukosa, laktosa dan sukrosa tidak difermentasikan, pada bagian slant dan butt akan berwarna merah. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 8 Uji pembentukan indol Satu ose kultur bakteri diinokulasikan ke dalam satu tabung medium tripton water dan kemudian diinkubasi selama 48 jam dan suhu 37 ° C. Satu tabung medium pepton water yang lain digunakan untuk kontrol tanpa inokulasi bakteri. Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 37 ° C. Reagen Kovac ditambahkan ke dalamnya setelah inkubasi. Bila terbentuk cincin merah yang tidak larut pada permukaan medium maka itu berarti hasilnya positif. Reaksi ini menunjukkan bahwa bakteri mampu menghasilkan enzim triptofanase yang bisa mengkatalisasi penguraian gugus indol dari triptofan sehingga indol akan menumpuk dalam medium biakan sebagai produk buangan. 9 Uji MR-VP Methyl Red-Voges Proskauer Kultur isolat bakteri diinokulasi dengan jarum inokulasi pada dua tabung yang berisi medium MR-VP. Dua tabung berisi medium yang sama untuk kontrol. Lalu diinkubasi selama 48 jam dan pada temperatur 37 ° C. Kemudian ditambah reagen methyl red pada dua tabung medium MR-VP yang satu kontrol, sedangkan dua tabung yang lain satunya kontrol ditambah 40 KOH dan 5 larutan α-naphtol. Hasil yang terjadi bila ada perubahan warna menjadi kuning pada uji MR, bakteri tersebut tidak dapat memfermentasikan glukosa. Sebaliknya bila tetap berwarna merah, terjadi fermentasi glukosa. Sedangkan bila ada perubahan warna menjadi merah muda pada uji VR, menandakan bahwa bakteri mampu memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3 butanadiol.

3. Isolasi Senyawa yang Dihasilkan oleh Bakteri dalam Susu Fermentasi