et al., 2001. Bakteri asam laktat sebagai starter culture biakan pemula yang berbeda-beda dengan fraksi susu sebagai starting substrate, menghasilkan produk
susu fermentasi yang berbeda-beda pula. Sour cream contohnya, menggunakan Streptococcus cremoris atau Lactobacillus lactis untuk menghasilkan asam laktat dan
Leuconostoc cremoris untuk menghasilkan rasa yang khas. Contoh lain, Bulgarian buttermilk dibuat oleh Lactobacillus bulgaricus sehingga menghasilkan asam laktat
dan rasa yang khas Atlas, 1997.
Tabel I. Beberapa ciri produksi dari susu yang difermentasi oleh bakteri asam laktat Pelczar Chan, 1988.
Produk Fermentasi Mikroorganisme Utama
Yang Melakukan Fermentasi Perubahan Yang
Dihasilkannya
Rum masam yang dibiaki mikroorganisme
Sama dengan yang digunakan untuk pembuatan susu mentega
yang dibiaki bakteri, yaitu Streptokokus, Leukonostok.
Asam dan rasa aroma
Susu bulgaria Lactobacillus bulgaricus
Asam dan rasa aroma
Susu acidofilus L. acidophillus
Asam dan rasa aroma
Yogurt Streptococcus termophilus
L. bulgaricus Asam dan rasa
aroma Kefir
S. lactis L. bulgaricus
Khamir peragi laktosa Asam dan rasa
aroma
Kumiss Sama dengan yang dijumpai
pada kefir Asam dan rasa
aroma
D. Senyawa Antibakteri dalam Bakteri Asam Laktat BAL
Senyawa antibakteri dalam bakteri asam laktat BAL yang paling banyak ditemukan adalah asam laktat. Bakteri asam laktat menghasilkan sejumlah besar
asam laktat sebagai hasil akhir dari metabolisme karbohidrat. Asam yang dihasilkan akan menurunkan nilai pH dari lingkungan pertumbuhannya dan menimbulkan rasa
asam. Hal ini akan menghambat pertumbuhan dari beberapa jenis mikroba patogen lainnya Buckle dkk, 1987. Ray Sandine 1992 melaporkan bahwa efek
antibakteri dari asam laktat sangat kecil. Asam laktat mengubah kondisi lingkungan menjadi asam pH sekitar 3,5. Banyak bakteri patogen dihambat pertumbuhannya
oleh kondisi asam tersebut dan tidak dapat tumbuh pada pH di bawah 4,5 Nester et al, 2001.
E. Bakteri Uji 1.
Escherichia coli
E.coli merupakan bakteri gram negatif, berbentuk batang lurus, fakultatif anaerob, fermentasi dan respirasi sebagai metabolismenya Holt, et al, 2000. E. coli
adalah anggota flora normal usus besar dan termasuk bakteri enterik. Bakteri enterik pada umumnya tidak menyebabkan penyakit dalam usus, tetapi berperan terhadap
fungsi dan nutrisi normal. Ketika terjadi infeksi yang penting secara klinik biasanya disebabkan oleh E. coli. Tempat paling sering terkena infeksi adalah saluran kemih,
saluran empedu, dan tempat lain di rongga perut. Ketika pertahanan normal inang menjadi tidak memadai yaitu pada bayi lanjut usia, pada pasien stadium akhir, pada
pasien pengguna obat imunosupressan, saat pemasangan kateter uretra infus vena, bakteri dapat bersifat patogen. Sifat patogennya dapat menyebabkan perempuan
mengalami infeksi saluran kemih juga menyebabkan infeksi pada saluran intestinal karena E.coli mengeluarkan enterotoksin, menginvasi dan mengkolonisasi usus; juga
menyebabkan infeksi nosokomial seperti sepsis dan meningitis Jawetz, 1996. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
E. coli penyebab yang lazim dari infeksi saluran kemih dan merupakan penyebab infeksi saluran kemih pertama pada kira-kira 90 wanita muda. E. coli
sangat sering menyebabkan diare dan ditemukan di seluruh dunia khususnya pada bayi di negara berkembang Jawetz dkk, 1996.
2. Enterococcus faecalis
E.faecalis merupakan bakteri yang mempunyai sel berbentuk cocci, berantai pendek, tidak membentuk endospora, gram positif, termasuk fakultatif anaerob dan
memfermentasi laktosa Holt et al., 2000 E.faecalis yang bergenus Enterococcus merupakan flora normal dari
gastrointestinal dan saluran kemih. Bakteri ini biasanya dapat menjadi penyebab penyakit pada manusia, dan penyakit tersebut dapat menjadi parah karena resisten
terhadap antimikroba Koneman et al., 1997. E.faecalis sering menyebabkan 85- 90 infeksi nokosomial. Tempat infeksi yang paling sering adalah saluran kemih,
luka tusuk, saluran empedu dan darah Jawetz dkk, 1996. Beberapa strain E.faecalis menghasilkan sitolisin cytolysin yang bertindak sebagai hemolisin yang menyerang
eritrosit manusia. E.faecalis lebih sering diisolasi dari spesimen klinis manusia dan dari saluran gastrointestinal manusia. Bakteri ini lebih sering diisolasi yang
menghubungkan dengan 80-90 infeksi enterokokal manusia Koneman et al., 1997.
F. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri
Pengujian potensi senyawa antibakteri dapat dilakukan dengan metode:
1. Metode difusi
Metode difusi merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengukur daya hambat obat terhadap bakteri dengan cara mencampurkan biakan ke dalam agar
cair dan membiarkannya hingga padat Jawetz Melnick, 1986 a Metode Kirby Bouwer : Suspensi bakteri dengan konsentrasi tertentu dioleskan
pada permukaan media hingga rata. Di atas media diletakkan paper disc yang mengandung bahan uji, kemudian diinkubasi pada 37
°C selama 18-24 jam dan hasil dibaca dengan mengukur zona hambatan Hugo Russel, 1987; Anonim,
1992. b Metode Sumuran : Penyiapan dilakukan seperti metode Kirby Bouwer. Setelah
biakan siap, dibuat sumuran dengan diameter tertentu dan tegak lurus permukaan media. Ke dalam sumuran diteteskan larutan uji, lalu inkubasi 18-24 jam pada
suhu 37 °C. Cara pembacaan hasil sama dengan cara Kirby Hugo Russel,
1987. Pengujian senyawa antibakteri dalam bentuk polimer sukar dan lambat berdifusi ke dalam agar Hurst Hoover, 1993. Menurut penelitian Riana
2001 pengujian daya hambat metabolit sekunder bakteri di dalam Susu Fermentasi Yakult
®
dan Kefir
®
Yoghurt terhadap E. coli dan S. aureus dengan metode difusi kurang efektif karena menurutnya metabolit sekunder bakteri
terebut sukar berdifusi ke dalam media agar. c Metode Paper Disc: Mula-mula 1 ml suspensi bakteri dicampur dengan 4 ml agar
base 1,5 pada temperatur 50°C kemudian dituang pada Mueller Hinton Agar PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dan dibiarkan membeku. Setelah itu letakkan disk dengan bahan uji di atasnya kemudian inkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Hasil dibaca seperti cara
Kirby Bouwer Trihendrokesowo, 1986.
2. Metode dilusi
Metode ini merupakan metode di mana sejumlah obat sebagai antibakteri dicampur dalam pembenihan mikrobia uji dalam bentuk cairpadat. Pada dilusi cair,
masing-masing konsentrasi obat ditambahkan suspensi mikrobia uji. Pada dilusi padat, setiap konsentrasi obat dicampurkan ke dalam media agar, setelah menjadi
padat baru ditanami mikrobia uji dan setelah itu diinkubasi Hugo Russel,1987. Obat dibuat dalam berbagai konsentrasi kemudian ditambahkan pada media
yang mengandung bakteri uji sehingga hasil yang diperoleh adalah kekeruhan. Kekeruhan menunjukkan adanya daya hambat obat pada konsentrasi tersebut. Oleh
karena itu, pada metode ini Minimum Inhibitory Concentration MIC dari obat tersebut dapat ditentukan. Ada tiga macam cara metode dilusi :
a Macro Broth Dilution. Obat dibuat dalam berbagai konsentrasi pada 10 tabung kemudian ditambahkan ke dalam media cair yang telah diinokulasi dengan
bakteri. Kemudian suspensi ini diinkubasi selama 15-16 jam pada suhu 35°C. Hasilnya dilihat dengan membaca kekeruhan pada masing-masing konsentrasi
sehingga bisa menentukan MIC Koneman et al, 1997. b Micro Broth Dilution. Cara kerja yang digunakan sama dengan metode Macro
Broth Dilution hanya tabung yang digunakan berbeda Koneman et al, 1997. c Agar Dilusi. Menggunakan satu seri plate agar, masing-masing mengandung
konsentrasi senyawa antibakteri yang berbeda yang berkisar pada dosis PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
terapeutik. Pembacaan hasil sama dengan metode Macro Broth Dilution Koneman et al, 1997.
3. Metode turbidimetri
Metode ini mengidentikkan pertumbuhan bakteri dengan kekeruhan yang diukur dengan spektrofotometer. Turbidimetri merupakan metode yang sangat cocok
untuk mengevaluasi pengaruh senyawa antibakteri pada saat pertumbuhan. Kelemahan metode ini adalah hanya populasi yang terkecil 10
6
CFUml yang dapat terdeteksi oleh spektrofotometer secara akurat. Oleh karena itu, metode turbidimetri
tidak dapat digunakan untuk mendeteksi jumlah bakteri dan perubahan jumlah populasi bakteri yang rendah. Pengukuran jumlah bakteri yang kurang dari 10
6
CFUml dengan spektrofotometer tidak memberikan perubahan nilai Optical Density OD Davidson Parish, 1989
G. Keterangan Empiris
Susu fermentasi diketahui mengandung bakteri asam laktat BAL yang dapat menekan pertumbuhan bakteri penyebab penyakit saluran pencernaan. Salah satu
produk susu fermentasi yang sudah beredar di Indonesia bahkan mancanegara adalah Yakult
®
. Produk ini mengandung bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat dapat menghambat bakteri patogen dan bakteri pembusuk flora normal yang berpotensi
patogen, seperti E.coli dan E.faecalis, yang mempunyai habitat di usus besar dan urogenital manusia.
Untuk mengetahui potensi antibakteri dan daya hambat dari senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult
®
terhadap E.coli dan E.faecalis, PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
maka perlu dilakukan pengujian potensi antibakteri senyawa tersebut dengan metode difusi paper disc dan diukur diameter zona hambat yang terbentuk. Tetapi sebelum
itu, bakteri dalam susu fermentasi Yakult
®
diisolasi dan diidentifikasi terlebih dahulu.
Data yang diperoleh dari identifikasi isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult
®
berupa data morfologi koloni, morfologi sel dan sifat biokimia. Data uji potensi dan identifikasi dianalisis secara deskriptif dan dilengkapi dengan gambar
mikrofotografi dan foto. Determinasi dilakukan dengan mencocokkan data hasil identifikasi morfologi koloni, morfologi sel, uji biokimia dengan menggunakan
buku pedoman baku determinasi bakteri Holt et al, 2000 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Isolasi bakteri dalam susu fermentasi Yakult
®
dengan metode streak plate
Isolat biakan murni bakteri dalam susu fermentasi Yakult
®
Identifikasi Isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult
®
Morfologi sel : 1. bentuk sel
2. rangkaian sel 3. pergerakan bakteri
4. sifat gram 5. adatidaknya spora
6. sifat acid fast Morfologi koloni :
Pertumbuhan bakteri dalam :
1. media MRS agar
miring, 2. media MRS agar
tegak, 3. media MRS agar
plate, 4. media MRS cair
Uji biokimia : 1. test katalase
2. test oksidase 3. test OF tanpa dan
dengan parafin 4. penggunaan sitrat
5. test dekarboksilase lisin
6. test hidrolisis gelatin 7. test pembentukan H
2
S 8. test Indol
9. test MR 10. test VP
Determinasi isolat bakteri berdasarkan buku panduan determinasi bakteri Holt et al., 2000
Genus isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult
®
Isolasi senyawa yang dihasilkan bakteri dalam susu fermentasi Yakult
®
Pengujian potensi antibakteri senyawa yang dihasilkan bakteri dalam susu fermentasi Yakult
®
terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis dengan
metode difusi paper disk
Gambar 1. Skema Kerja Penelitian
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian