BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Alat – alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, neraca analitis, pH meter, penangas air, termometer, lempeng
logam berdiameter 2,1 cm, jangka sorong, mortir dan stamfer, gunting, pisau cukur, sudip, spatula, dan pot plastik.
3.2 Bahan – bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak buah mengkudu Morinda citrifolia L., Na-CMC Brataco Chemical, air suling,
gliserin, dan gel Bioplacenton
®
.
3.3 Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan adalah kelinci putih jantan dengan berat 1,5 - 2 kg.
3.4 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Laboratorium Herbarium Medanense, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.
Universitas Sumatera Utara
3.5 Pembuatan Simplisia 3.5.1 Pengambilan dan pengolahan sampel
Pengambilan dan pengolahan sampel akan dilakukan secara purposive tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama di daerah lain. Sampel
diambil dari pohon yang tumbuh di sekitar lingkungan perumahan di Jl. Jermal, Kelurahan Denai, Kecamatan Medan Denai, Medan, Sumatera Utara.
3.5.2 Pengolahan simplisia
Simplisia yang diperoleh dicuci lalu ditiriskan. Setelah kering, simplisia ditimbang dan dicatat sebagai berat basah simplisia, kemudian dirajang.
Dimasukkan ke dalam lemari pengering. Setelah kering, ditimbang, dan dihitung susut pengeringan simplisia.
3.6 Standardisasi Simplisia
Standardisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, pemeriksaan mikroskopik, penetapan kadar air dengan metode azeotropi
WHO, 1998, penetapan kadar sari larut dalam air, penetapan kadar sari larut dalam etanol Ditjen POM, 1979, penetapan kadar abu total, dan penetapan
kadar abu tidak larut asam Ditjen POM, 2008.
3.6.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati sifat morfologi luar simplisia berupa irisan buah, berwarna cokelat, berbau khas, rasa sedikit
pahit, dengan ketebalan ± 1 cm, diameter 3-5 cm, dengan tonjolan-tonjolan biji Ditjen POM, 2008.
Universitas Sumatera Utara
3.6.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisa buah mengkudu. Serbuk simplisia ditaburkan di atas kaca objek yang telah ditetesi
dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. Fragmen pengenal adalah testa, serabut, epikarp,
dan endokarp Ditjen POM, 2008. Serbuk: Berwarna hitam kecoklatan.
3.6.3 Penetapan kadar air simplisia
Dimasukkan 5 gram simplisia yang telah ditimbang dengan seksama ke dalam labu alas bulat yang berisi 200 ml toluen dan 2 ml air, lalu dipanaskan
hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian
kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes setiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi
dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca
dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung
dalam persen Ditjen POM, 1979.
3.6.4 Penetapan kadar sari larut air
Ditimbang seksama 5 g serbuk simplisia, dimasukkan ke dalam labu bersumbat, ditambahkan dengan 100 ml air jenuh kloroform, dikocok berkali-
berkali selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam. Disaring, diuapkan 20
Universitas Sumatera Utara
ml filtrat hingga kering di dalam cawan berdasar rata yang telah dipanaskan 105
o
C dan ditara. Dipanaskan sisa pada suhu 105
o
C hingga bobot tetap. Dihitung kadar dalam sari larut air Ditjen POM, 2008.
3.6.5 Penetapan kadar sari larut etanol
Ditimbang seksama 5 g serbuk simplisia, dimasukkan ke dalam labu bersumbat, ditambahkan 100 ml etanol 95 P, dikocok berkali-kali selama 6
jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Disaring, diuapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam cawan berdasar rata yang telah dipanaskan 105
o
C dan ditara. Dipanaskan sisa pada suhu 105
o
C hingga bobot tetap. Dihitung kadar dalam sari larut etanol Ditjen POM, 2008.
3.6.6 Penetapan kadar abu total
Ditimbang seksama 2 sampai 3 g bahan uji yang telah dihaluskan dan dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijar dan ditara, dipijarkan
perlahan-lahan hingga arang habis, didinginkan dan ditimbang. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air
panas, diaduk, disaring melalui kertas saring bebas abu. Dipijarkan kertas saring beserta sisa penyaringan dalam krus yang sama. Dimasukkan filtrat ke
dalam krus, diuapkan dan dipijarkan hingga bobot tetap. Kadar abu total dihitung terhadap berat bahan uji, dinyatakan dalam bb Ditjen POM,
2008.
3.6.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam
Dididihkan abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total dengan 25 ml asam klorida encer LP selama 5 menit. Dikumpulkan bagian yang tidak
Universitas Sumatera Utara
larut dalam asam, disaring melalui kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas, dipijarkan dalam krus hingga bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut
dalam asam dihitung terhadap berat bahan uji, dinyatakan dalam bb Ditjen POM, 2008.
3.7 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia mengkudu dilakukan terutama pemeriksaan senyawa saponin dengan mengocok ekstrak alkohol-air dari tumbuhan dengan
air dalam tabung reaksi dan diperhatikan pembentukan busa tahan lama pada permukaan cairan Harborne, 1987.
3.7.1 Skrining fitokimia golongan alkaloida
Ditimbang 500 mg serbuk simplisia, ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan,
dan disaring. Filtrat dipindahkan masing-masing 3 tetes ke dalam 3 spot plate atau tabung reaksi dan ditambahkan 2 tetes larutan pereaksi Meyer, Bouchardat
dan Dragendorf. Jika terdapat alkaloid maka akan terbentuk endapan menggumpal putih atau kuning dengan LP Meyer, endapan coklat sampai
hitam dengan LP Bouchardat, dan endapan kuning jingga dengan LP Dragendorf. Simplisia dikatakan mengandung alkaloid apabila 2 dari 3 reaksi
memberikan reaksi positif. Dilanjutkan percobaan dengan mengocok sisa filtrat dengan 3 ml
amonia pekat dan 10 ml campuran eter-kloroform 3:1, diambil fase organik dan ditambahakn natrium sulfat anhidrat, disaring. Diuapkan filtrat di atas
penangas air, dilarutkan sisa dalam sedikit asam klorida 2 N. Dilakukan
Universitas Sumatera Utara
percobaan dengan menambah ketiga larutan pereaksi. Simplisia dikatakan mengandung alkaloid apabila 2 dari 3 reaksi memberikan reaksi positif Ditjen
POM
b
, 1995.
3.7.2 Skrining fitokimia golongan glikosida
Ditimbang 3 g serbuk simplisia dan dimasukkan ke dalam labu, ditambahkan 30 ml campuran etanol 95 - air 7:3, ditambahkan asam sulfat
hingga diperoleh pH larutan 2, kemudian direfluks dengan menggunkan pendingin bola selama 10 menit, dinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat
ditambahkan 25 ml air dan 25 ml larutan timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit, disaring. Diekstrasi filtrat sebanyak 3 kali, tiap kali
dengan 20 ml campuran pelarut kloroform – isopropanol 3:2 kemudian diperoleh dua lapisan cairan. Dikumpulkan masing-masing sari yang terdiri
dari sari air dan sari pelarut organik. Pada kumpulan sari pelarut organik ditambahkan natrium sulfat anhidrat, disaring, diupkan pada suhu tidak lebih
dari 50
o
C. Dilarutkan sisa dengan 2 ml etanol. Uji terhadap senyawa gula:
Dimasukkan sari air ke dalam tabung reaksi, diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes LP Molisch. Ditambahkan 2 ml
asam sulfat pekat, terbentuk seperti cincin berwarna ungu pada batas cairan menunjukkan adanya ikatan gula.
Uji terhadap senyawa non gula:
Universitas Sumatera Utara
Diuapkan sari pelarut organik di atas penangas air, dilarutkan sisa dalam 5 tetes asam cuka anhidrat. Ditambahkan 10 tetes asam sulfat pekat, terbentuk larutan
berwarna biru, hijau, merah ungu atau ungu Ditjen POM
b
, 1995.
3.7.3 Skrining fitokimia golongan glikosida sianogenik
Ditimbang 10 g simplisia, dihaluskan dalam lumpang dan dilembabkan dengan sedikit air dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kertas saring yang
telah dibasahi dengan larutan asam pikrat diselipkan dengan bantuan gabus pada mulut erlenmeyer. Dibiarkan terkena sinar matahari. Timbulnya warna
merah pada kertas saring menunjukkan adanya glikosida sianogenik Ditjen POM
b
, 1995.
3.7.4 Skrining fitokimia golongan glikosida antrakuinon
Dicampurkan 200 mg serbuk simplisia dengan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, didinginkan. Ditambahkan 10 ml benzena P, dikocok,
didiamkan. Dipisahkan lapisan benzena, disaring; filtrat berwarna kuning, menunjukkan adanya antrakinon. Dikocok lapisan benzena dengan 1 ml sampai
2 ml natrium hidroksida 2 N, didiamkan; lapisan air berwarna merah intensif dan lapisan benzena tidak berwarna Ditjen POM
b
, 1995.
3.7.5 Skrining fitokimia golongan saponin
Dimasukkan 0,5 g serbuk simplisia yang diperiksa ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat
selama 10 detik; terbentuk buih yang mantap selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1 cm sampai 10 cm. Pada penambahan 1 tetes asam klorida 2 N, buih
tidak hilang Ditjen POM
b
, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.7.6 Skrining fitokimia golongan tanin
Ditimbang 0,5 g serbuk simplisia, dimaserasi dengan aquades 10 ml selama 15 menit. Disaring, filtrat diencerkan dengan akuades sampai hampir
tidak berwarna. Diambil 2 ml filtrat, ditambahkan 2 tetes larutan FeCl
3
10. Diperhatikan warna yang terjadi; biru atau hijau menunjukkan adanya tanin.
3.7.7 Skrining fitokimia golongan flavonoida
Disari 0,5 g serbuk simplisia yang diperiksa, ditambahkan 10 ml metanol P menggunakan alat pendingin balik selama 10 menit. Disaring panas
melalui kertas saring berlipat, diencerkan filtrat dengan 10 ml air. Setelah dingin, ditambahkan 5 ml eter minyak tanah P, dikocok hati-hati, didiamkan.
Diambil lapisan metanol, diuapkan pada suhu 40
o
C di bawah tekanan. Sisa dilarutkan dalam 5 ml etil asetat P, disaring.
1. Diuapkan hingga kering 1 ml larutan percobaan , sisa dilarutkan dalam 1
ml sampai 2 ml etanol 95 P, ditambahkan 0,5 g serbuk seng P dan 2 ml asam klorida 2 N, didiamkan selama 1 menit. Ditambahkan 10 tetes asam
klorida pekat P, jika dalam waktu 2 sampai 5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoid glikosida-3-flavonol.
2. Diuapkan hingga kering 1 ml larutan percobaan, dilarutkan sisa dalam 1
ml etanol 95 P, ditambahkan 0,1 g serbuk magenesium P dan 10 tetes asam klorida pekat P, jika terjadi warna merah jingga sampai merah ungu
menunjukkan adanya flavonoid. Jika terjadi warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon, kalkon, dan auron.
Universitas Sumatera Utara
3. Diuapkan hingga kering 1 ml larutan percobaan, dibasahkan sisa dengan
aseton P, ditambahkan sedikit serbuk halus asam borat P dan serbuk halus asam oksalat P, dipanaskan hati-hati di atas penangas air dan dihindari
pemanasan yang berlebihan. Dicampur sisa yang diperoleh dengan 10 ml eter P. Diamati dengan sinar ultraviolet 366 nm; larutan berflurosensi
kuning intensif, menunjukkan adanya flavonoid Ditjen POM
b
, 1995.
3.7.8 Skrining fitokimia golongan triterpensteroid
Ditimbang 1 g serbuk simplisia, ditambahkan eter lalu didiamkan selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisanya
ditambahkan asam asetat anhidrida kemudian diteteskan dengan asam sulfat pekat. Timbulnya warna ungu dan merah kemudian berubah menjadi hijau biru
menunjukkan adanya triterpensteroida.
3.8 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan menggunakan metode perkolasi dengan etanol 70. Buah mengkudu Morinda citrifolia L. dipilih yang matang,
disortasi basah, dicuci bersih, ditiriskan, diiris dengan ketebalan 3-5 mm, lalu dikeringkan di oven pada suhu 40-60°C. Simplisia kering diserbuk dengan
menggunakan mesin penyerbuk Pratiwi, dkk., 2011. Ditimbang simplisia dan
dimaserasi dengan etanol 70, didiamkan 3 jam. Massa kemudian dipindahkan ke dalam perkolator, kemudian ditambahkan pelarut etanol 70 sampai
simplisia benar-benar terendam. Ditutup perkolator dan didiamkan selama 24 jam. Dibuka keran perkolator sehingga perkolat menetes, sementara cairan
penyari ditambahkan berulang-ulang secukupnya. Perkolasi dihentikan setelah
Universitas Sumatera Utara
cairan yang keluar telah jernih atau setelah 500 mg perkolat diuapkan tidak meninggalkan sisa. Perkolat yang ditampung kemudian disatukan dan diuapkan
dengan rotari evaporator pada suhu tidak lebih dari 50
o
C hingga diperoleh ekstrak kental.
3.9 Pembuatan Sediaan Gel
Sediaan gel diorientasi menggunakan tiga jenis formula basis untuk memperoleh sediaan gel yang baik.
- Formula I Agoes, 2008
R Carbomer 941 0,5
Gliserin 10,0 TEA
0,5 Air
89,0 Metil
paraben 0,18
- Formula II Maryawati, 2006
R HPMC 3
Propilenglikol 15
Metil paraben
0,18 Air
suling ad
100 -
Formula III Susanti, 2009 R
Na-CMC 2
Metil paraben 0,18
Air suling
2 Gliserin ad
100 Dari ketiga jenis formula basis, konsistensi gel yang diamati secara
visual paling baik adalah formula basis gel ketiga. Pembuatan sediaan gel dilakukan dengan komposisi yang sesuai dengan
orientasi yang dilakukan sebelumnya. R
Ekstrak buah mengkudu 0,5 g
Na-CMC 0,2 g
Metil paraben 0,018 g
Air suling 4 ml
Gliserin ad
10 g
Universitas Sumatera Utara
Tabel 3.1 Formula gel dengan variasi konsentrasi ekstrak buah mengkudu
Bahan Formula
gel g
A B C D E F G H I
Ekstrak buah
mengkudu - 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5
Na-CMC 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Metil
paraben 0,018 0,018
0,018 0,018 0,018 0,018 0,018 0,018 0,018 Air suling
4 4
4 4
4 4 4
4 4
Gliserin ad 10
10 10
10 10 10
10 10
10
Keterangan: A = dasar gel tanpa ekstrak buah mengkudu B =
gel dengan kadar ekstrak buah mengkudu 1 C =
gel dengan kadar ekstrak buah mengkudu 3 D =
gel dengan kadar ekstrak buah mengkudu 5 E =
gel dengan kadar ekstrak buah mengkudu 7 F =
gel dengan kadar ekstrak buah mengkudu 9 G =
gel dengan kadar ekstrak buah mengkudu 11 H =
gel dengan kadar ekstrak buah mengkudu 13 I =
gel dengan kadar ekstrak buah mengkudu 15 Sediaan gel dibuat dengan komposisi berdasarkan hasil orientasi yaitu
sediaan gel yang memberikan efek penyembuhan terbaik yaitu menggunakan gel yang mengandung ekstrak buah mengkudu 5 yang diperoleh dalam 13
hari.
3.10 Evaluasi Sediaan