commit to user
25
Sampel Bandingkan
tikus putih A
K2 HK2
dengan uji 27 ekor
statistik K3
HK3
Keterangan : A : Adapatasi selama tujuh hari di dalam Laboratorium Sentral MIPA
UNS. K1 : Kelompok satu sebagai kontrol, tidak diberi perlakuan bising.
K2 : Kelompok dua diberi paparan bising kontinyu sebesar 72 dB. Pengaturan bising yang digunakan adalah 5 jam paparanhari,
selama waktu tiga 3 hari. K3 : Kelompok tiga diberi paparan bising kontinyu sebesar 90 dB.
Pengaturan bising yang digunakan adalah 5 jam paparanhari, selama waktu tiga 3 hari.
HK1: Pengamatan kadar CD8
+
pada kelompok 1. HK2: Pengamatan kadar CD8
+
pada kelompok 2. HK3: Pengamatan kadar CD8
+
pada kelompok 3.
H. Instrumen dan Bahan Penelitian
Instrumen yang digunakan adalah sebagai berikut: 1. Sirine elektrik: Frekuensi yang digunakan adalah 350 Hz
commit to user
26
2. Sound Level Meter 3. Kandang
4. Timbangan Torbal 5. Termometer ruangan
6. Higrometer mengukur tahap kelembapan ruangan 7. Kloroform anestesi
Bahan yang digunakan adalah sebagai berikut: 1. 1cc darah tikus putih
2. Makanan hewan percobaan 3. Minuman hewan percobaan
4. Reagen FITC anti-rat CD8
+
antibody
I. Cara Kerja
1. Adaptasi Hewan Coba
commit to user
27
Hewan percobaan diadaptasikan di rumah kaca Laboratorium Sentral MIPA Biologi UNS selama tujuh hari dengan pemberian makanan
dan minuman. Makanan yang diberikan sebesar 8-25 gramhari untuk masing-masing tikus Jan dan Gerald, 2003 dan minuman 15-30 ml per
hari. Hewan percobaan ini ditempatkan dalam kandang di mana tiap kandang terdiri atas 9 ekor tikus.
2. Kadar CD8
+
- Flow Ctyometry Flow Cytometry menggunakan prinsip pencaran cahaya, eksitasi
cahaya dan emisi molekul flourokrom untuk menghasilkan data multi- parameter spesifik dari partikel atau sel dengan saiz diameter berkisar dari
0.5µm hingga 40 µm. Sel secara hidrodinamik difokuskan dalam PBS phosphate buffer saline sebelum dipintas dengan sumber fokus cahaya
yang optimal. Cahaya laser paling sering dipakai sebagai sumber cahaya dalam flow cytometry. Pencaran dan emisi cahaya dari sel dan partikel
dirubah menjadi gelombang listrik oleh pengesan optik optical detector. Bentuk gelombang cahaya parelel ini diangkat oleh lenca konfokal yang
difokuskan pada titik persilangan antara sel dan sumber cahaya. Cahaya dihantar pengesan-pengesan berbeda oleh filter optik. Tipe pengesan yang
paling sering dipakai flow cytometry adalah tuba fotomultiplier PMT. Gelombang listrik yang dideteksi oleh PMT adalah berasal dari cahaya
dan diproses oleh amplifier linear dan log secara berseri. Amplifikasi
commit to user
28
logaritmik paling sering dipakai untuk mengukur fluoresen dalam sel. Tipe ini mampu merubah sinyal yang lemah kepada kuat sehingga boleh
diukur. Setelah itu, sinyal-sinyal atau gelombang-gelombang yang berbeda ini akan diproses oleh ADC Analog to Digital Converter dan
diplotkan kepada skala grafik One Parameter, Two Parameter Hisotograms. Data output akan disimpan dalam fail komputer
menggunakan standar FCS 2.0 atau 3.0 sebagai fail listmode atau fail histogram Ormerod, 2000.
Flow Cytometry dipilih sebagai instrumen pengukuran karena mempunyai kelebihan dalam mengukur fluoresen secara per sel dan
partikel. Hasil pengukuran adalah lebih akurat dan subjektivitas pengukuran CD8
+
menjadi sangat rendah berbanding dengan ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay dan spektrofotometri Rahman,
2009. a. Penyediaan Sampel untuk Flow Cytometry
Teknik ini digunakan apabila fluorokrom molekul flouresen secara langsung
dihubungkan ke
antibodi primer
contohnya PE
phycoerythrin, PITC fluorescein isothiocyanate dan konjugat Alexa Fluor® Alexa Fluor® 488 Anti-mouse CD8a Antibody, Merek
Biolegend digunakan oleh peneliti.
commit to user
29
1 Sediakan sel. Siapkan suspensi sel kepad konsentrasi 1.106 selml menggunakan buffer PBSBSA. phosphate buffered saline pH 7.4
and 1 bovine serum albumin. Sampel darah segar boleh digunakan tanpa diencerkan melainkan jumlah sel yang tinggi
contoh: pasien leukemia. EDTA dan heparin adalah anti-koagulan pilihan.
2 Ambil dan masukkan 100 µl suspensi sel darah segar ke dalam seberapa banyak tabung uji yang dikehendaki.
3 Masukan antibodi pada dilusi yang direkomendasikan lihat lembar data spesifik. Campurkan dengan sebaiknya dan
inkubasikan pada suhu kamar selama 30 menit. 4 Cuci sel dengan menggunakan 2 ml PBSBSA. Sentrifudge pada
400g selama 5 menit dan buang supernatan. Untuk suspensi darah, masukkan buffer lisis sel darah
merah e.g. 2 ml AbD Serotec’s Erythrolyse dan campurkan dengan baik. Inkubasikan 10 menit pada suhu kamar. Sentrifudge pada
400g selama 5 menit dan buang supernatan. Sel yang ditangguhkan pemeriksaanya disimpan dalam 0.2 PBSBSA atau 0.2 ml 0.5
paraformaldehyde dalam PBSBSA jika diperlukan.
J. Pelaksanaan Penelitian
