Kerangka kerja Bahan, Peralatan dan Cara Kerja

3.9. Kerangka kerja

Pasien inklusi demam 2 atau 2 hari -ve +ve NS1 AG test • Trombosit • Lekosit • Monosit Darah rutin LPB Darah rutin Gambar 10 • Trombosit • Lekosit • Monosit LPB Gambar 10. Kerangka Kerja

3.10. Bahan, Peralatan dan Cara Kerja

Dilakukan pemeriksaan laboratorium 1. NS-1 Ag test 2. Darah rutin 3. Sediaan hapus darah untuk melihat keberadaan LPB Nany: Limfosit Plasma Biru Nilai Diagnostik Pada Infeksi Dengue, 2007. USU e-Repository © 2008

3.10.1. Dilakukan pemeriksaan NS-1Ag test

Seluruh pasien degan panas 2 hari atau lebih yang memenuhi kriteria inklusi Dilakukan pemeriksaan NS1-Ag test, dibagi 2 kelompok NS1-Ag + dan NS1-Ag- Kit NS1-Ag dengan nama dagang Platelia Dengue NS1Ag yang menditeksi antigen virus dengue pada serum darah manusia. Dalam satu kit terdiri dari 10 kemasan R1- R10. RI terdiri dari mikroplate yang berisi murine monoklonial antibodi MAb, R2 adalah larutan pencuci R3 negatip kontrol, R4 cut-off kontrol, R5 positip kontrol,R6 larutan konjugasi, R7 sebagai pelarut, R8 sebagai pelarut zat pewarna, R9 sebagai zat pewarna, R10 sebagai penghenti reaksi. Prinsip kerja adalah reaksi antibodi-antigen. Kit menggunakan murine monoklonial antibodi MAb, bila sampel mengandung NS- 1Ag akan berikatan dengan MAb membentuk immun komplek MAb-NS1Ag-MAb, dengan reaksi pewarnaan khromogenik, dibaca menggunakan metode Mikroelisa EIA, yang dibaca pada gelombang 450620nm dengan alat Microelisa reader membandingkan optikal density sampel dengan optical densiti kontrol. Bila rasio 0,5 diinterprestasi sebagai negative, bila rasio atau sama dengan 0,5 atau 1,0 diinterprestasikan ragu- ragu, bila rasio atau sama dengan 1,0 maka diinterprestasikan positive. Prosedur kerja: 1. Menyiapkan larutan pencuci yaitu mencampur R2 30ml dalam air 270ml air destilasi 1:10 2. Mempersiapkan larutan konjugasi R6 250ml dalam R7 12,25ml 1:50 3. Isi R7 ke mikroplate 50µl Nany: Limfosit Plasma Biru Nilai Diagnostik Pada Infeksi Dengue, 2007. USU e-Repository © 2008 4. Masukkan larutan R3, R4, R5 dan sample kemikroplate 50µl 5. Masukkan larutan knjugasi 100µl ke mikroplate, terjadi perubahan warna dari warna orange menjadi hijau 6. Inkubasi dalam inkubator dengan temperatur 37 derajat celsius selama 90 menit 7. Siapkan kromogen yaitu larutan R9+R8 1:11, sebelum selesai inkubasi 8. Isap dan cuci 6 kali dengan larutan R2 memakai alat washer 9. Masuk 160µl larutan kromogen ke mikroplate 10. Inkubasi selama 30 menit pada temperatur ruangan 18-30 derajat celsius dan pada tempat gelap 11. Masukkan larutan R10 ke mikroplate100µl untuk menghentikan reaksi 12. Baca dengan alat Mikro Ellisa Reader dengan gelombang 450620nm Nany: Limfosit Plasma Biru Nilai Diagnostik Pada Infeksi Dengue, 2007. USU e-Repository © 2008 Peralatan Dibawah ini ditampilkan peralatan yang dipergunakan 1 Kit dan alat inkubator Gambar11. Kit Platellia NS1 Ag Biorad Gambar12. Inkubator Nany: Limfosit Plasma Biru Nilai Diagnostik Pada Infeksi Dengue, 2007. USU e-Repository © 2008 2 Washer dan Mikro Ellisa Reader Gambar 13. Washer Gambar14. Mikro Ellisa Reader Nany: Limfosit Plasma Biru Nilai Diagnostik Pada Infeksi Dengue, 2007. USU e-Repository © 2008 Gambar15. Printer Masing-masing kelompok dilakukan pemeriksaan darah rutin ,melihat trombosit, lekosit, monosit dan sedian hapus darah untuk melihat LPB.

3.10.2. Dilakukan pemeriksaan hapusan darah

Alat yang diperlukan : Objek gelas, kaca penggeser objek gelas dek gelas dan hemolet dan regensia : Larutan Giemsa. Cara membuat: 1. Diambil objek gelas yang bersih, kering dan bebas debu dan bebas lemak. Dan juga kaca penggeser objek gelas yang mempunyai sisi pendek yang rata sedangkan salah satu sudutnya dipotong sedikit. 2. Ujung jari pasien dibersihkan dengan alkohol, biarkan kering, kemudian tusuk dengan hemolet yang mana arah tusukan membuat sikutegak lurus dengan garis-garis jari. Nany: Limfosit Plasma Biru Nilai Diagnostik Pada Infeksi Dengue, 2007. USU e-Repository © 2008 3. Pegang dengan tangan kanan sebuah kaca objek dan sentuhankan setetes darah kecil padanya tanpa menyentuh kulit jari pasien. Letakkan kaca tersebut diatas meja dengan tetesan darah di sebelah kanan. 4. Pegang dengan tangan kanan sebuah kaca objek penggeser dan letakkan sisi pendeknya disebelah kiri tetesan darah. Kemudian gerakkan kearah tetesan darah sehingga menyentuhnya. 5. Darah yang telah menyebar kesisi pendek kaca objek segera dihapuskan kea rah kiri sambil memegang dengan posisi miring 30-45 derajat 6. Biarkan hapusan kering, setelah itu beri tandakode. 7. Letakkan sediaan diatas rak, kemudian sedian difiksasi dengan methanol metal alkohol. selama 5-7 menit. Bila menggunakan alkohol absolute fiksasi harus 15-20 menit. 8. Setelah alkohol dibung bubuhi sediaan dengan larutan kerja Giemsa selama 20 menit. 9. Buang zat warna dan bilas dengan air kran, keringkan sedian tegak lurus di atas kertas saring Pembacaan hapusan darah tepi dilakukan oleh petugas yang berbeda dengan petugas laboran yang memeriksa NS-1Ag test dan peneliti akan memeriksa ulang. Nany: Limfosit Plasma Biru Nilai Diagnostik Pada Infeksi Dengue, 2007. USU e-Repository © 2008

3.10.3. Dilakukan hitung jenis lekosit

Cara kerja 1. Periksa hapusan darah yang telah diwarnai dan dikeringkan dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 ×, cari dimana eritrosit tersebar merata. Biasanya terdapat dibagian tipis sediaan. 2. Lensa objektif diganti dengan pembesaran 40×, kemudian 100×, dan sediaan diberi minyak imersi. 3. Golongkan dan catat tiap sel berinti pada daerah yang dilalui sampai genap 100 sel. Kemudian masing-masing dibuat persentasenya

3.10.4. Morfologi LPB

Lebih besar dari ukuran limfosit, dengan pewarnaan Giemsa , sitoplasma basofilik, biru gelap, pada bagian pinggir nukleous lobulated. Inti bulat atau oval , bentuk ginjal terbagi atau letak eksentrik, sedikit kromatin dibandingkan limfosit.

3.10.5 . Nilai diagnostik

Dilakukan pemeriksaan LPB serial setiap hari. LPB akan memperlihatkan, LPB pada dengue mencapai puncak pada hari ke sekian. Dan menunjukkan rata-rata persentasi LPB, diperoleh nilai cut off atau titik batas sensitivitas dan spesifisitas. Membandingkan angka rata-rata LPB pada orang dengue dan tidak dengue secara serial. Perhitungan student t test terhadap angka rata- rata LPB pada kelompok dengue dan tidak dengue. Pemeriksaan hematologi terdiri dari, jumlah lekosit, jumlah trombosit, LPB. Dilakukan penilaian statistik tunggal, sensitiviti, spesitiviti, predictive value LPB terhadap NS1-Ag. Dilakukan penilaian statistik berganda Nany: Limfosit Plasma Biru Nilai Diagnostik Pada Infeksi Dengue, 2007. USU e-Repository © 2008 sensitiviti, spesitiviit, LPB dengan trmbosit, Dilakukan penilaian statistik berganda sensitiviti LPB dengan lekosit.. Dilakukan penilaian statistik LBP dengan monosit .Dilakukan penilaian statistik LBP dengan lekosit dan monosit Dalam hitung jenis lekosit, LPB termasuk kedalam kelompok limfosit. Contoh angka lekosit : 15000. Batang : 2 Segmaen : 45 Eosinofil : 0 Limfosit : 50 LPB 10 Monosit : 3 Basofil :0 ------------------------------------------ jumlah : 100 LPB 10 dari total sel lekosit , dari 50 limfosit terdapat 10 LPB Jumlah absulut LPB dengan mengalikan LPB dengan lekosit. Jumlah absulut LPB :10 × 1500

3.10.6. Analisa data

Data yang terkumpul diolah dengan menggunakan program SPSS. Pengujian statistik yang dilakukan dengan tes diagnosik, menghitung sensitivitas, spesitifitas, nilai ramal positip, nilai ramal negatip, Index Yauden dan Reciever Opreting CharasteristiROC.Untuk membandingkan nilai rata-rata dua kelompok dilakukan uji-t. Nany: Limfosit Plasma Biru Nilai Diagnostik Pada Infeksi Dengue, 2007. USU e-Repository © 2008 • Dilakukan perhitungan sensitivitas, spesifisitas, nilai ramal positip, nilai ramal negatip.dengan rumus BAKU EMAS Ya TIDAK JUMLAH HASIL UJI YA A B A+B TIDAK C D C+D A+C B+D A+B+C+D A= positip benar true positip B= positip semu false positip C= negatip semu false negatip D= negatip benar true negatip Sensitifitas = AA+C= positip benar positip benar+ negatip semu Spesitifias = DB+D= negatip benar negatip benar+positp semu Nilai ramal positip = AA+B= positip benar+positip semu Nilai ramal negatip = DB+D= negatip benar+negatip semu • Mencari nilai cut off atau titik batas sensitivitas dan spesitivitas • Uji t test : membandingkan LPB pada kelompok dengue dan tidak dengue 1. membandingkan LPB dengan NS1- Ag 2. membandingkan LPB + trombosit 3. membandingkan LPB + lekosit 4. membandingkan LPB + monosit Nany: Limfosit Plasma Biru Nilai Diagnostik Pada Infeksi Dengue, 2007. USU e-Repository © 2008 BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN Penelitian dilakukan di Rumah Sakit di Kota Medan. Subjek penelitian terdiri dari 63 subjek yang dirawat di RS. Semua subjek yang dirawat yang telah panas 2 hari diperiksa NSIAg, Sejumlah 63 subjek. Sejumlah 38 orang 60,32 yang diperiksa dijumpai NSIAg tes positip, sejumlah 25 orang 39,68 subjek dijumpai NS 1 Ag tes negatip. Dua subjek dari kelompok subjek NS1Ag negatip selama masa perawatan satu subjek dijumpai Malaria falciparum sehingga dikeluarkan dari subjek penelitian. Satu subjek yang lainnya selama masa rawatan dijumpai Appendicitis sehingga dikeluarkan dari subjek penelitian, sehingga subjek penelitian akhir 61 subjek. Kelompok subjek yang positip NS1Ag tes dan kelompok subjek dengan negatip NS1Ag tes dilakukan pemeriksaan secara seri setiap hari LPB, hemoglobin, hematokrit, limfosit, monosit, seperti alur di bawah ini , Gambar 16. Alur Pemeriksaan NSIAg NS1Ag+ Pasien demam ≥2 hari LPB,Hb,Ht Trombosit,Limfo sit,Mononosit LPB, Hb,HT, Trombosit,limfosit Monosit NS1Ag- Nany: Limfosit Plasma Biru Nilai Diagnostik Pada Infeksi Dengue, 2007. USU e-Repository © 2008

4.1 Jumlah Kasus Menurut Hari Demam