BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini adalah metode eksperimental yang meliputi identifikasi tumbuhan, pengumpulan bahan tumbuhan, pengolahan sampel, karakterisasi
simplisia, pembuatan simplisia skrining fitokimia, pembuatan ekstrak secara meserasi, isolasi secara kromatografi kertas ,uji kemurnian dan identifikasi senyawa
isolat secara spektrofotometri ultraviolet menggunakan pereaksi geser shift reagent. 3.1 Alat-alat yang digunakan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, blender National, oven listrik Stork, neraca kasar Ohaus, neraca
analitik Mettler tolede, penangas air Yenaco, krus tang, eksikator, penguap vakum putar Buchi 461, mikroskop Olympus, krus porselin, tanur Gallenkamp,
seperangkat alat penetapan kadar air, bejana, pipa kapiler, lampu uv, hair dryer, dan seperangkat alat spektrofotometer ultraviolet Shimadzu UV-1240.
3.2 Bahan-bahan yang digunakan
Bunga pacar air merah Impatiens balsamina Linn. Semua bahan-bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisis
E.Merck yaitu etanol hasil destilasi, air suling, raksa II klorida, kalium iodida, natrium hidroksida, iodium, bismut III nitrat, asam asetat glasial, besi III klorida,
asam klorida pekat, asam sulfat pekat, timbal II asetat, asam nitrat, asam asetat anhidrida, isopropanol, kloroform, benzen, n-heksan, etilasetat, serbuk magnesium,
Universitas Sumatera Utara
kloralhidrat, toluen, kertas saring, kertas saring bebas abu Whatman no. 40, kertas whatman no. 1 dan kertas Whatman no. 3.
3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.3.1 Pereaksi Mayer
Sebanyak 2,266 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml. Pada wadah lain dilarutkan 50 g kalium iodida dilarutkan dalam 100 ml air suling.
Kemudian 60 ml larutan I dicampurkan dengan 10 ml larutan II dan ditambahkan dengan air suling hingga 100 ml MMI, 1989
3.3.2 Pereaksi Natrium Hidroksida
Sebanyak 8,002 g natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling hingga diperoleh 100 ml larutan Farmakope Indonesia, 1979
3.3.3 Pereaksi Bouchardat
Kalium iodida 4 g dilarutkan dalam air suling, ditambahkan dengan iodium sebanyak 2 g dan dicukupkan dengan air suling hingga 100 ml MMI, 1989
3.3.4 Pereaksi Dragendorff
Bismut II nitrat sebanyak 0,85 g dilarutkan dalam 10 ml asam asetat glasial. Lalu di tambahkan dengan 40 ml air suling. Pada wadah yang lain 8 g kalium iodida
dilarutkan dalam 20 ml air suling, masing-masing larutan diambil 5 ml dan ditambahkan 20 ml asam asetat kemudian dicukupkan dengan air suling hingga 100
ml MMI, 1989
Universitas Sumatera Utara
3.3.5 Pereaksi Besi III Klorida 1 bv
Besi III klorida sebanyak 1 g dilarutkan dalam air suling sehingga 100 ml MMI,
1989. 3.3.6. Pereaksi Asam Klorida 2N
Asam korida pekat sebanyak 17 ml diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Farmakope Indonesia, 1979
3.3.7 Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 M
Timbal asetat sebanyak 15,17 g dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Materia Medika Indonesia, 1989
3.3.8 Pereaksi Molish
Alfa naftol sebanyak 3 g dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml MMI1989
3.3.9 Pereaksi Aluminium Klorida 5 bv
Timbang 5 g aluminium klorida, lalu dilarutkan dalam etanol sampai volume
100 ml Harborne, 1989. 3.3.10
Pereaksi Kloralhidrat
Kloralhidrat dilarutkan dalam aquadest sampai larutan nya jenuh.
3.4 Pengambilan dan Pengolahan Sampel 3.4.1 Pengambilan sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif tanpa membandingkannya dengan daerah lain. Sampel yang digunakan adalah bunga tumbuhan pacar air
Impatiens balsamina Linn yang bewarna merah yang segar yang diperoleh dari
Universitas Sumatera Utara
depan halaman rumah masyarakat di Kelurahan Siulak deras, Kecamatan Gunung Kerinci, Kabupaten Kerinci, Propinsi Jambi.
3.4.2 Identifikasi Sampel
Identifikasi tumbuhan dilakukan oleh Balai Penelitian dan Pengembangan Botani, Puslitbang Biologi – LIPI, Bogor. Hasil identifikasi tumbuhan yang diteliti
adalah Impatiens balsamina Linn, suku Balsaminaceae. Hasil identifikasi dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 24.
3.4.3 Pengolahan Sampel
Bunga pacar air merah yang telah dikumpulkan dibersihkan dari pengotoran dengan menggunakan air bersih, ditiriskan, ditimbang berat basah nya yaitu 4 kg
hasil kemudian dikeringkan dalam lemari pengering, setelah kering ditimbang beratnya yaitu 220 g hasil. Sampel dianggap kering bila diremas rapuh, simplisia
selanjutnya diserbuk dengan menggunakan blender.
3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia, penetapan kadar air, penetapan kadar sari
yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam MMI, 1989, WHO,
1992.
3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan untuk mengetahui ciri-ciri, bentuk, dan ukuran dari simplisia bunga tumbuhan pacar air merah Impatiens balsamina Linn
Universitas Sumatera Utara
secara organoleptis dengan cara mengamati bentuk, warna, dan bau. Hasil pemeriksaan makroskopik dapat dilihat pada lampiran 2 gambar 2 halaman 25.
3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia dengan cara menaburkan serbuk simplisia diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan kloralhidrat
dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian dilihat dibawah mikroskop. Dapat dilihat pada lampiran 3 halaman 26.
3.5.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Cara Kerja:
a. Penjenuhan Toluen
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan kedalam labu alas bulat, didestilasi selama 2 jam, kemudian toluen didinginkan selama 30 menit dan
volume air pada tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05.
b. Penetapan kadar air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu alas, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen
mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian
dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan
toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. selisih kedua
Universitas Sumatera Utara
volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992.
3.5.4 Pemeriksaan Kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air sampai 1 liter dalam
labu tersumbat sambil dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam. Disaring, sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering, dalam cawan dangkal
berdasarkan rata dan telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105 C sampai bobot
tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara MMI, 1989.
3.5.5 Penetapan Kadar Sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu tersumbat sambil dikocok sesekali selama
6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol, 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan
dangkal berdasar rata yang telah ditara dan dipanaskan pada suhu 105 C sampai
bobot tetap. Kadar sari dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara MMI, 1989.
3.6.6 Penetapan Kadar Abu total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porslen yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan dan dipijarkan
pada suhu 600 C sampai arang habis. Kemudian didinginkan dan ditimbang sampai
Universitas Sumatera Utara
diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara WHO, 1992.
3.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida 2N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan,
disaring melalui kertas saring bebas abu kemudian dicuci dengan air panas dalam krus porslen. Residu dan kertas saring dipijarkan pada suhu 600
C sampai bobot tetap. Kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang dikeringkan di udara WHO, 1992. Hasil karakterisasi simplisia dapat dilihat pada lampiran 4 tabel 1 halaman 27
dan perhitungan karakterisasi dapat dilihat pada lampiran 4 lanjutan.
3.6 Penapisan Fitokimia Serbuk Simplisia
Penapisan fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan senyawa golongan alkaloida, flavonoida, saponin, tanin, glikosida, glikosida antrakuinon, dan
steroidtriterpenoid.
3.6.1 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas air selama 2 menit, didinginkan
dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: a.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal bewarna putih atau kekuningan.
Universitas Sumatera Utara
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat,
akan terbantuk endapan bewarna coklat sampai hitam. c.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendroff, akan terbentuk endapan jingga atau coklat jingga.
Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari percobaan diatas MMI, 1989.
3.6.2 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambahkan dengan 100 ml air panas, di didihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, diambil 5 ml filtrat
dimasukkan dalam tabung reaksi, kedalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan
dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1996.
3.6.3 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok selama 10 detik, jika
terbantuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya
saponin MMI, 1989.
3.6.4 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak bewarna. Larutan diambil sebanyak 2
Universitas Sumatera Utara
ml dan ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida 1, jika terjadi warna biru atau hijau menunjukkan adanya tanin MMI, 1989.
3.6.5 Pemeriksaan glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air suling 7 : 3 dan 10 ml asam sulfat 2 N , di refluk selama 1 jam,
didinginkan dan disaring, pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, diamkan 5 menit lalu disari, filtrat disaring dengan
20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2 : 3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Kumpulkan sari air, uapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 C sisanya
dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa dimasukkan dalam tabung reaksi selanjutnya diuapkan diatas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes
larutan pereaksi Molish. Tambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat melalui dinding tabung terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya glikosida
MMI, 1989. 3.6.6
Pemeriksaan glikosida antrakinon
Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditambah 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzena, dikocok dan didiamkan.
Lapisan benzen dipisahkan dan disaring. Kocok lapisan benzen dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan, lapisan NaOH bewarna merah dan lapisan benzen tidak bewarna
menunjukkan adanya antrakinon MMI, 1989.
3.6.7 Pemeriksaan steroida triterpenoida
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada sisanya ditambahkan 20
Universitas Sumatera Utara
tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Lieberman- Bouchard. Apabila terbantuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru
hijau menunjukkan adanya steroidatriterpenoida Harborne, 1987. Hasil skrining fitokimia dapat dilihat pada lampiran 4 tabel 2 halaman 27.
3.7 Pembuatan ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan secara maserasi dengan menggunakan pelarut etanol yang mengandung HCl pekat 1 dari jumlah penyaripelarut. Posedur
pembuatan ekstrak sebagai berikut : Sebanyak 100 mg simplisia direndam di dalam wadah kaca dengan pelarut yang mengandung HCl pekat 1. dari jumlah
penyaripelarut, 2000 ml penyari ditambahkan dengan 20 ml HCl pekat. Rendam selama 24 jam sambil sekali-kali diaduk, setelah 24 jam maserat disaring, kemudian
di maserasi lagi dengan penambahan pelarut yang mengandung HCl pekat 1 dari jumlah penyaripelarut, Ekstraksi telah sempurna ditandai dengan bila hasil saringan
maserat tidak bewarna lagi. Ekstrak yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan. Dapat dilihat pada lampiran 6 gambar 6 halaman 34.
3.8 Analisis senyawa antosianin dari ekstrak etanol dengan cara
Kromatografi Kertas KKt
Terhadap ekstrak etanol dilakukan KKt dengan pengembang BAA yaitu n- butanol – asam asetat – air 40:10:50 yang diambil lapisan atas yaitu n-butanol,
Forestal yaitu asam asetat- air- HCl 30:10:3, dan asam asetat 30 yaitu asam asetat- air 10:30. diperoleh dari kromatogram yang terbaik pada pengembang asam asetat
30 pada analisis senyawa antosianin dari ekstrak etanol dengan cara kromatografi
Universitas Sumatera Utara
kertas digunakan fase gerak asam asetat 30 asam asetat – air dengan perbandingan 3:7, fase diam kertas Whatman No. 3 yang berukuran 3 X 27 cm.
Estrak etanol ditotolkan 2 cm dari tepi bawah pada kertas Whatman No. 1 kemudian kertas tersebut dimasukkan kedalam bejana berisi fase gerak yang telah
dijenuhkan. Lalu dikembangkan dengan jarak rambat 23 cm. Kertas diangkat dan dikeringkan. Hasil disemprot dengan pereaksi AlCl
3
dalam etanol dilihat dibawah sinar ultraviolet. Hasil dapat dilihat pada lampiran 8 gambar 8 halaman 36
3.9 Pemisahan senyawa antosianin dari ekstrak etanol dengan cara
