4
2.2 Persiapan Probiotik
Pada penelitian ini bakteri probiotik yang digunakan adalah bakteri Vibrio SKT-b yang telah diuji dapat menghambat pertumbuhan V. harveyi secara in vitro
dan in vivo serta telah diidentifikasi sebagai bakteri Vibrio alginolyticus Widanarni et al. 2003.
Media yang digunakan untuk persiapan probiotik adalah SWC Sea Water Complete. Terlebih dahulu media SWC dan PBS Phosphate Buffer
Saline disiapkan Lampiran 1. Tahap selanjutnya yaitu media SWC cair steril sebanyak 25 mL diinokulasikan satu ose isolat bakteri Vibrio SKT-b yang
berumur 24 jam yang dilakukan secara aseptik. Selanjutnya hasil inokulasi tersebut diinkubasi dalam waterbath shaker pada suhu 29-30
o
C dengan kecepatan 140 rpm selama 24 jam. Setelah itu, suspensi bakteri dipindahkan ke dalam
tabung corning 25 mL kemudian disentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 5.000 rpm untuk memisahkan pellet dengan supernatan. Padatan sel bakteri
pellet yang diperoleh kemudian dicuci sebanyak 2 kali dengan larutan PBS 25 mL, dihomogenisasi dengan vortex dan disentrifuse selama 10 menit dengan
kecepatan 5.000 rpm dan supernatan dibuang. Setelah itu, ditambahkan kembali larutan PBS sebanyak 10 mL dan dihomogenisasi dengan vortex. Hasil dari vortex
ini adalah probiotik yang akan dicampurkan ke dalam pakan.
2.3 Pengujian Prebiotik, Probiotik, dan Sinbiotik secara In Vivo 2.3.1 Persiapan Wadah
Wadah yang digunakan dalam penelitian ini adalah 15 akuarium berukuran 60 cm x 30 cm x 35 cm. Sebelum digunakan, akuarium dicuci terlebih dahulu
menggunakan deterjen dan dikeringkan. Kemudian akuarium didesinfeksi menggunakan kaporit 100 ppm selama 24 jam. Setelah itu dibilas dengan air
tawar hingga bersih dan diisi dengan air laut sebanyak 40 L pada masing-masing akuarium. Air laut didesinfeksi dengan larutan klorin 30 mgL dan diaerasi kuat
selama 24 jam. Kemudian ditambahkan sodium tiosulfat 15 mgL untuk menetralkan kandungan klorin dan diaerasi kuat selama minimal 4 jam. Masing-
masing akuarium dilengkapi dengan shelter sebagai tempat udang berlindung ketika molting.
5
2.3.2 Persiapan Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah udang vaname stadia PL Post Larvae 38 yang berasal dari Labuan, Banten. Sebelum perlakuan,
benur dipelihara sampai memiliki bobot 2 gekor. Pemeliharaan udang dilakukan selama 30 hari untuk pengujian nilai sintasan dan respon imun dengan kepadatan
20 ekorakuarium atau 100 ekorm
2
.
2.3.3 Persiapan Pakan Uji
Pakan yang digunakan selama penelitian ini adalah pelet komersil dengan kandungan protein 40 dan diberikan sebanyak 4 kali sehari. Dosis probiotik
yang digunakan sebesar 1 vw dari jumlah pakan yang akan diberikan Wang 2007. Sedangkan dosis prebiotik yang digunakan sebesar 2 vw dari jumlah
pakan yang akan diberikan Mahious et al. 2006. Untuk pembuatan sinbiotik dilakukan dengan cara mengkombinasikan probiotik dan prebiotik pada pakan
yang akan diberikan dengan menambahkan kuning telur sebanyak 2 vw dari total pakan yang berfungsi sebagai perekat Wang 2007. Sebelum diberikan ke
udang, pakan dikeringudarakan terlebih dahulu selama 10-15 menit untuk mengurangi kelembaban.
2.3.4 Persiapan Ko-infeksi Bakteri dan Virus
Uji tantang yang dilakukan dalam penelitian ini adalah ko-infeksi bakteri V. harveyi dan IMNV. Infeksi V. harveyi dilakukan dengan metode perendaman
imersi. Setelah itu udang diinfeksi IMNV dengan metode injeksi. Udang vaname positif IMNV didapatkan dari Balai Pengembangan Budidaya Air Payau
BPBAP Situbondo, Jawa Timur. Pembuatan ekstrak IMNV yang akan digunakan untuk injeksi berdasarkan prosedur yang dilakukan Escobedo et al.
2006. Adapun prosedur pembuatan ekstrak IMNV yaitu daging udang positif IMNV dicacah tanpa hepatopankreas, usus, dan karapas dan kemudian
dilarutkan dalam PBS dengan perbandingan daging udang dan PBS adalah 1:10. Setelah itu disentrifuse dengan kecepatan 6.500 rpm pada suhu 4
o
C selama 20 menit. Supernatan diambil dan dimasukkan dalam mikrotube baru, kemudian
disentrifuse dengan kecepatan 13.000 rpm 4
o
C selama 20 menit. Selanjutnya supernatan diambil dan difilter dengan syringe filter 0,45 µm. Hasil filter itu
merupakan stok ekstrak virus IMNV dan disimpan pada suhu -70
o
C. Udang
6 diinjeksi dengan IMNV pada bagian punggung antara segmen 3 dan 4 sebanyak
100 µL Tang et al. 2005. Setelah itu dilakukan kultur bakteri V. harveyi yang digunakan untuk
infeksi secara imersi. Kepadatan bakteri V. harveyi yang digunakan adalah 10
6
CFUmL dan imersi dilakukan selama 30 menit di dalam wadah terpisah yaitu 20 ekor udang2 L Widagdo 2011. Pengamatan dilakukan selama 14 hari setelah
dilakukan koinfeksi.
2.3.5 Pengujian Pakan Uji pada Udang Vaname
Pengujian ini terdiri dari 5 perlakuan dengan 3 kali ulangan. Rancangan perlakuan penelitian dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Rancangan perlakuan pemberian prebiotik, probiotik, dan sinbiotik dengan ko-infeksi V. harveyi dan IMNV.
Pemberian pakan dilakukan empat kali dalam sehari pada pukul 07.00, 11.00, 15.00, dan 19.00 WIB. Jumlah pakan yang diberikan didasarkan pada
Feeding Rate FR menurut SNI 01-7246-2006 yaitu 15 menurun hingga 10. Pengelolaan kualitas air dilakukan dengan penyiponan dan pergantian air setiap
pagi hari sebanyak 10 dari total volume akuarium. Pemeliharaan udang dengan perlakuan prebiotik, probiotik dan sinbiotik
dilakukan selama 30 hari, kemudian dilakukan uji tantang dengan ko-infeksi V. harveyi dan IMNV. Kemudian udang ditempatkan kembali ke dalam akuarium
pemeliharaan. Pemeliharaan pasca uji tantang dan pengamatan dilakukan selama 14 hari. Parameter yang diamati selama perlakuan dan pasca uji tantang adalah
sintasan, laju pertumbuhan harian LPH, rasio konversi pakan FCR, total hemosit, diferensial hemosit, total bakteri dan total bakteri SKT-b, gejala klinis,
dan kualitas air.
Perlakuan Keterangan
K + Pemberian pakan komersil tanpa penambahan prebiotik, probiotik, dan sinbiotik
dengan ko-infeksi V. harveyi dan IMNV. K -
Pemberian pakan komersil tanpa penambahan prebiotik, probiotik, dan sinbiotik tanpa ko-infeksi V. harveyi dan IMNV.
P1 Pemberian pakan komersil dengan penambahan prebiotik dengan ko-infeksi V.
harveyi dan IMNV. P2
Pemberian pakan komersil dengan penambahan probiotik dengan ko-infeksi V. harveyi dan IMNV.
P3 Pemberian pakan komersil dengan penambahan sinbiotik dengan ko-infeksi V.
harveyi dan IMNV.
7
2.4 Parameter Uji 2.4.1 Sintasan
Sintasan atau kelangsungan hidup merupakan presentase ikan yang hidup,
dengan rumus sebagai berikut Effendi 2004 :
Sintasan Keterangan :
Nt = jumlah individu pada akhir perlakuan hari ke-t
No = jumlah individu pada awal perlakuan hari ke-0
2.4.2 Laju Pertumbuhan Harian
Bobot udang diukur setiap 10 hari sekali selama pemeliharaan, dan laju pertumbuhan harian dihitung sebagai berikut Huisman, 1987:
100 1 x
Wo Wt
t LPH
x t
1
Keterangan : LPH = Laju pertumbuhan harian
Wt = Bobot rata-rata pada akhir perlakuan g
Wo = Bobot rata-rata pada awal perlakuan g
t = Periode pemeliharaan hari
2.4.3 Rasio Konversi Pakan
Rasio konversi pakan atau Feeding Conversi Ratio FCR selama pemeliharaan dihitung menggunakan rumus Zonneveld et al. 1991 :
Keterangan : FCR = Konversi pakan
F = Jumlah pakan g Bt = Biomassa udang pada saat akhir perlakuan g
Bm = Biomassa udang yang mati saat perlakuan g Bo = Biomassa udang pada saat awal perlakuan g
100 x
No Nt
8
2.4.4 Total Hemosit
Pengamatan terhadap total hemosit dilakukan pada akhir perlakuan probiotik, prebiotik dan sinbiotik hari ke-29 serta pasca ko-infeksi V. harveyi
dan IMNV hari ke-44. Penghitungan total hemosit yaitu dengan cara haemolymph diambil sebanyak 0,1 mL per ekor udang tiap ulangan dari pangkal
kaki renang pertama dengan menggunakan syringe 1 mL yang sudah berisi 0,3 mL antikoagulan Na-sitrat 3,8. Kemudian campuran tersebut dihomogenkan,
tetesan pertama dibuang sedangkan tetesan selanjutnya diteteskan pada haemositometer dan diamati di bawah mikroskop.
2.4.5 Diferensial Hemosit
Pembuatan preparasi untuk diferensial hemosit dilakukan pada akhir perlakuan probiotik, prebiotik dan sinbiotik hari ke-29 serta pasca ko-infeksi V.
harveyi dan IMNV hari ke-44. Tahap pertama yaitu haemolymph yang telah diambil dari udang uji diteteskan pada gelas objek dan dibuat ulasan, kemudian
dikeringkan. Setelah itu difiksasi dengan methanol 100 selama 5 menit dan dikeringkan di udara kembali. Tahap selanjutnya yaitu preparat tersebut diwarnai
dengan larutan giemsa 10 selama 15 menit dan dikeringkan di udara. Kemudian dicuci dalam
air mengalir selama 30 detik dan dibiarkan kering.
Jumlah hemosit dihitung hingga 100 sel dan ditentukan persentase tiap jenisnya hialin dan
granular. Persentase tiap jenis sel hemosit dihitung dengan rumus: jenis sel hemosit =
x 100
2.4.6 Total Bakteri dan Total SKT-b Pengamatan total bakteri dilakukan pada akhir perlakuan pada hari ke-30
dan pasca uji tantang hari ke-32 dan hari ke-45. Perhitungan total bakteri ini berdasarkan jumlah bakteri dalam usus udang. Usus diambil dan ditimbang
bobotnya, lalu dimasukkan ke dalam larutan PBS dengan perbandingan 1:10. Setelah itu usus digerus sampai homogen dengan larutan PBS, lalu diambil
sebanyak 0,1 mL dan dilakukan pengenceran bertingkat sampai pengenceran 10
-7
. Kemudian hasil pengenceran tersebut dituang dalam cawan petri dengan metode
agar tuang pada media SWC dan TCBS yang mengandung rifampisin 50 µgml TCBS + Rf Widanarni et al. 2003 dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24
9 jam. Pada media SWC semua bakteri akan tumbuh, sedangkan pada media TCBS
+ Rf hanya bakteri Vibrio SKT-b yang akan tumbuh karena telah dibuat resisten terhadap antibiotik rifampisin Ayuzar 2008.
2.4.7 Gejala Klinis
Pengamatan gejala klinis dilakukan dengan melihat perubahan atau kelainan pada anatomi makro udang. Gejala klinis yang diamati ialah
terbentuknya otot berwarna putih pada bagian ruas tubuh udang, dan warna kemerahan pada bagian ekor. Pengamatan gejala klinis ini dilakukan pada awal
dan akhir uji tantang.
2.4.8 Kualitas Air
Kualitas air diukur pada awal dan akhir perlakuan prebiotik, probiotik, dan sinbiotik. Pengamatan kualitas air dilakukan pada air stok awal dan air media
pemeliharaan masing-masing perlakuan. Parameter kualitas air yang diukur adalah suhu, pH, DO, salinitas, dan TAN.
2.5 Analisis Data
Penelitian ini menggunakan rancangan percobaan berupa Rancangan Acak Lengkap RAL. Untuk parameter laju pertumbuhan harian LPH, rasio konversi
pakan FCR, gambaran darah total hemosit dan diferensial hemosit,
dan total bakteri
data dianalisis menggunakan software Mc. Excel 2007 dan SPSS versi 17 serta uji lanjut untuk beda nyata menggunakan uji Duncan. Sedangkan untuk
parameter sintasan dan total bakteri SKT-b, data diolah menggunakan software Mc. Excel 2007 dan dibahas secara deskriptif.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil 3.1.1 Sintasan
Penghitungan nilai sintasan dilakukan pada akhir perlakuan prebiotik, probiotik, dan sinbiotik serta pasca uji tantang dengan ko-infeksi V. harveyi dan
IMNV. Nilai sintasan pada tahap perlakuan dan pasca uji tantang dapat dilihat pada Gambar 1.
a b
Keterangan : K + kontrol +, K - kontrol -, P1 prebiotik, P2 probiotik, dan P3 sinbiotik
Gambar 1 Nilai sintasan udang vaname pada akhir perlakuan prebiotik, probiotik, dan sinbiotik a; Nilai sintasan udang vaname pada pasca uji tantang
dengan ko-infeksi V. harveyi dan IMNV b. Berdasarkan Gambar 1a, pada akhir perlakuan prebiotik, probiotik, dan
sinbiotik menunjukkan bahwa nilai sintasan tertinggi terdapat pada perlakuan probiotik yaitu 88,33, kemudian perlakuan sinbiotik yaitu 85,00, perlakuan
kontrol dengan 81,67, dan sintasan terendah terdapat pada perlakuan prebiotik yaitu 76,67. Sedangkan pada pasca uji tantang 1b perlakuan probiotik
memiliki nilai sintasan tertinggi yaitu 79,17, disusul kemudian perlakuan prebiotik dan K- yaitu 75,00, perlakuan sinbiotik yaitu 70,83, dan sintasan
terendah terdapat pada perlakuan K+ yaitu 50,00.
3.1.2 Laju Pertumbuhan Harian
Penghitungan laju pertumbuhan harian LPH udang vaname pada penelitian ini dilakukan setelah 30 hari perlakuan prebiotik, probiotik, dan
sinbiotik yang dapat dilihat pada Gambar 2.
81.67 76.67
88.33 85
10 20
30 40
50 60
70 80
90 100
K P1
P2 P3
Sintasan
50.00 75.00
75.00 79.17
70.83
20 40
60 80
100
K + K -
P1 P2
P3
Sin ta
sa n
Kategori