fenolik Kumalaningsih, 2006. Salah satu antioksidan alami yang berperan sebagai antioksidan adalah flavanoid. Senyawa ini berperan sebagai penangkap
radikal bebas karena mengandung gugus hidroksil. Karena bersifat sebagai reduktor, flavonoid dapat bertindak sebagai donor hidrogen terhadap radikal bebas
Silalahi, 2006. Antioksidan sintetik dibuat dari bahan-bahan kimia yang biasanya
ditambahkan ke dalam bahan pangan untuk mencegah terjadinya reaksi autooksidasi Kumalaningsih, 2006.
Struktur dasar dan sistem penomoran untuk turunan flavonoid dapat dilihat pada
Gambar 2.1.
Gambar 2.1 Struktur dasar flavonoid Robinson, 1995
2.5 Spektrofotometer Visibel
Prinsip kerja Spektrofotometer Visibel adalah sinarcahaya dilewatkan melewati sebuah wadah kuvet yang berisi larutan, dimana akan menghasilkan
spektrum. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan
konsentrasi larutan di dalam kuvet. Alat ini menggunakan hukum Lambert Beer sebagai acuan Ewing, 1975.
Spektrofotometer pada dasarnya terdiri atas sumber sinar monokromator, tempat sel untuk zat yang diperiksa, detektor, penguat arus dan alat ukur atau
pencatat. Panjang gelombang untuk sinar ultraviolet antara 200-400 nm sedangkan panjang gelombang untuk sinar tampakvisible antara 400-750 nm
Rohman, 2007.
2.6 Metode Pengukuran Antioksidan
Beberapa tahun belakangan ini, pengujian absorbansi oksigen radikal telah digunakan untuk mengevaluasi dan mengukur aktivitas antioksidan pada
makanan, serum dan cairan biologi lainnya. Metode analisa ini mengukur aktivitas dari antioksidan dalam melawan radikal bebas seperti 1,1- diphenyl-2-
picrylhydrazyl DPPH radikal, anion superoksida radikal O
2
·, hidroksi radikal OH· atau peroksi radikal ROO·. Bermacam-macam metode yang digunakan
untuk mengukur aktivitas antioksidan dari produk makanan dapat memberikan hasil yang beragam tergantung pada spesifitas dari radikal bebas yang digunakan
sebagai reaktan Sunarni, dkk., 2007. Perkiraan aktivitas antioksidan bergantung kepada sistem pengujiannya.
Spesifitas dan sensitifitas satu metode saja tidak dapat menguji seluruh senyawa fenol yang terdapat pada ekstrak. Oleh karena itu dibutuhkan kombinasi pengujian
aktivitas antioksidan lebih dari satu Sun dan Ho, 2005. Pada uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode
β-karoten-asam linoleat, radikal bebas terbentuk dari hidroperoksid yang dihasilkan oleh asam linoleat. Radikal bebas
asam linoleat terbentuk karena pengurangan atom hidrogen dari satu gugus metilen dialil yang menyerang ikatan rangkap pada beta karoten sehingga terjadi
oksidasi beta karoten yang menyebabkan hilangnya gugus kromofor yang
memberi warna orange Rosidah, dkk., 2008. Perubahan warna ini dapat diukur secara spektrofotometri.
Rumus bangun β-karoten dapat dilihat pada Gambar 2.2.
Gambar 2.2
Rumus bangun β-karoten Robinson, 1995 Panjang gelombang maksimum λ
maks
yang digunakan dalam pengukuran metode
β-karoten-asam linoleat menurut literatur adalah 470 nm Rosidah, dkk., 2008; Sugiastuti, 2002. Lama pengukuran metode
β-karoten-asam linoleat menurut literatur yang direkomendasikan adalah 0 menit sampai 120 menit
dengan interval waktu 15 menit Rosidah, dkk., 2008. DPPH pertama kali ditemukan pada tahun 1922 oleh Goldschmidt dan
Renn. DPPH berwarna ungu pekat seperti KMnO4, bersifat tidak larut dalam air Ionita, 2003. DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil merupakan radikal bebas
yang stabil pada suhu kamar dan sering digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau ekstrak bahan alam. DPPH menerima elektron
atau radikal hidrogen akan membentuk molekul diamagnetik yang stabil. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen pada
DPPH, akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH Molyneux, 2004. Struktur kimia DPPH dapat dilihat pada Gambar 2.3.
DPPH radikal bebas DPPH non radikal
Gambar 2.3 Struktur kimia DPPH Molyneux,2004
Metode pemerangkapan radikal 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH adalah suatu metode sederhana yang dapat digunakan untuk menguji kemampuan
antioksidan yang terkandung dalam makanan. Metode ini dapat digunakan untuk sampel yang padat dan bentuk larutan. Prinsipnya adalah elektron ganjil pada
molekul DPPH memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang tertentu, berwarna ungu. Warna akan berubah dari ungu menjadi kuning lemah
apabila elektron ganjil tersebut berpasangan dengan atom hidrogen yang disumbangkan senyawa antioksidan. Perubahan warna ini berdasarkan reaksi
kesetimbangan kimia Prakash, 2001. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil karena resonansi yang
dialaminya. Resonansi juga menyebabkan peningkatan kepekatan warna ungu Molyneux, 2004. Resonansi DPPH dapat dilihat pada Gambar 2.4.
Gambar 2.4 Resonansi DPPH Ionita, 2003
Ketika larutan DPPH dicampurkan dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, akan dihasilkan bentuk tereduksi dari DPPH dan
berkurangnya warna ungu Molyneux, 2004. Reaksi antara DPPH dengan atom H dari senyawa antioksidan dapat dilihat pada Gambar 2.5.
Gambar 2.5 Reaksi antara DPPH dengan senyawa antioksidan Molyneux, 2004.
Panjang gelombang maksimum λ
maks
yang digunakan dalam pengukuran sampel uji sangat bervariasi. Menurut beberapa literatur panjang gelombang
maksimum untuk DPPH antara lain 515 nm, 516 nm, 517 nm, 518 nm, 519 nm dan 520 nm. Apabila pengukuran menghasilkan tinggi puncak maksimum, maka
itulah panjang gelombangnya yaitu sekitar panjang gelombang yang disebutkan di atas. Nilai absorbansi yang mutlak tidaklah penting, karena panjang gelombang
dapat diatur untuk memberikan absorbansi maksimum sesuai dengan alat yang digunakan Molyneux, 2004.
Lama pengukuran metode DPPH menurut beberapa literatur yang direkomendasikan adalah selama 60 menit, tetapi dalam beberapa penelitian
waktu yang digunakan sangat bervariasi yaitu 5 menit, 10 menit, 20 menit, 30 menit dan 60 menit. Waktu reaksi yang tepat adalah ketika reaksi sudah mencapai
kesetimbangan. Kecepatan reaksi dipengaruhi oleh sifat dari aktivitas antioksidan yang terdapat di dalam sampel Molyneux, 2004; Rosidah, dkk., 2008.
BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental. Penelitian meliputi pengumpulan dan penyiapan bahan, karakterisasi simplisia,
skrining fitokimia, pembuatan ekstrak etanol dan uji aktivitas antioksidan dengan metode
β-karoten-asam linoleat dan metode pemerangkapan radikal bebas DPPH dengan menggunakan alat spektrofotometer visibel.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan terdiri dari alat-alat gelas laboratorium, spektofotometer UVVis Shimadzu UV-1800, rotary evaporator Heidolph VV-
300, freeze dryer Edwards, mikroskop, neraca kasar Ohaus, neraca analitis Vibra, oven listrik Strok, penangas air Yenaco, desikator, tanur
Gallenkamp, blender National, seperangkat alat penetapan kadar air, cawan porselin dan lemari pengering.
3.2 Bahan-bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah buah kesemek segar yang sudah tua. Bahan-bahan kimia yang berkualitas pro analisis
yaitu β-karoten, Tween 40, asam linoleat, DPPH Sigma, butil hidroksianisol BHA, butil
hidroksitoluena BHT, kuersetin, vitamin C Scharlau chemie SAthe Europian Union, produksi E-Merck: metanol, toluen, kloroform, isopropanol, benzen, n-
heksan, asam nitrat pekat, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, raksa II
