28
3.10 Penyiapan Plasma Darah Tikus
Diambil 1,5 ml cuplikan darah dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge. Ditambahkan 1,5 ml TCA 20 kemudian divortex dan disentrifugasi dengan
kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Diambil supernatan, dimasukkan ke dalam vial, dan disimpan dalam lemari pembeku.
3.11 Pengukuran Kadar Nitrit dan Nitrat Pada Plasma 3.11.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Nitrit
Serbuk natrium nitrit dikeringkan pada suhu 110° C selama satu jam, kemudian didinginkan dalam desikator. Ditimbang 100 mg natrium nitrit yang
telah dikeringkan dan didinginkan, kemudian dipindahkan dalam labu tentukur 100 ml secara kuantitatif dan dilarutkan dengan air suling, lalu dicukupkan
volumenya sampai garis tanda C = 1000,0 μgml LIB I. Dipipet 1 ml LIB I di atas dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml lalu diencerkan dengan air
suling sampai garis tanda C = 10,0 μgml LIB II.
3.11.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Nitrit Baku
Dipipet 4 ml LIB II dan dimasukkan dalam labu tentukur 50 ml, ditambahkan 2,5 ml pereaksi asam sulfanilat 1 bv dan dikocok. Setelah 5 menit,
ditambahkan 2,5 ml pereaksi NED 0,1 bv dan dicukupkan dengan air suling sampai garis tanda kemudian dihomogenkan. Diukur serapan pada panjang
gelombang 400- 800 nm dengan blanko air suling C = 0,8 μgml.
3.11.3 Penentuan Waktu Kerja Nitrit Baku
Dipipet 4 ml LIB II dan dimasukkan dalam labu tentukur 50 ml, ditambahkan 2,5 ml pereaksi asam sulfanilat 1 bv dan dikocok. Setelah 5 menit,
ditambahkan 2,5 ml pereaksi NED 0,1 bv dan dicukupkan dengan air suling
Universitas Sumatera Utara
29 sampai garis tanda kemudian dihomogenkan. Diukur serapan pada panjang
gelombang maksimum 540 nm dalam selang waktu 1 menit selama 60 menit.
3.11.4 Penentuan Kurva Kalibrasi Nitrit Baku
Dari LIB II C = 10,0 μgml, dipipet masing-masing sebanyak 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2; 3; 4; 5 dan 6 ml 0,05 μgml; 0,1 μgml; 0,15 μgml; 0,2 μgml; 0,4
μgml; 0,6 μgml; 0,8 μgml; 1,0 μgml; 1,2 μgml. Masing-masing dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml. Ditambahkan 2,5 ml pereaksi asam sulfanilat 1
bv pada setiap labu tentukur kemudian dikocok. Setelah 5 menit, ditambahkan 2,5 ml pereaksi NED 0,1 bv, dikocok dan diencerkan sampai garis tanda
dengan air suling dan dihomogenkan. Diukur serapan setelah menit ke-12 dimana warna stabil pada panjang gelombang maksimum 540 nm.
3.11.5 Pengukuran Kadar Nitrit dalam Plasma
Sebanyak 1 ml plasma dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml. Ditambahkan 2,5 ml pereaksi asam sulfanilat 1 bv kemudian dikocok. Setelah 5
menit, ditambahkan 2,5 ml pereaksi NED 0,1 bv, dikocok dan diencerkan sampai garis tanda dengan air suling dan dihomogenkan. Diukur serapan setelah
menit ke-12 dimana warna stabil pada panjang gelombang maksimum 540 nm.
3.11.6 Pengukuran Kadar Nitrat dalam Plasma
Sebanyak 1 ml plasma dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml. Ditambahkan 10 mg serbuk Zn kemudian dikocok. Setelah 10 menit, ditambahkan
2,5 ml pereaksi asam sulfanilat 1 bv kemudian dikocok. Setelah 5 menit, ditambahkan 2,5 ml pereaksi NED 0,1 bv, dikocok dan diencerkan sampai garis
tanda dengan air suling dan dihomogenkan. Diukur serapan setelah menit ke-12 dimana warna stabil pada panjang gelombang maksimum 540 nm.
Universitas Sumatera Utara
30
3.12 Pengambilan Organ Jantung Hewan Uji
Pengambilan organ jantung pada tikus dilakukan pada hari ke 7. Organ jantung yang telah diambil, difiksasi dengan larutan buffer netral formalin 10
untuk dibuat preparat histopatologi. Kondisi organ dalam larutan buffer netral formalin 10 terendam seluruhnya dan waktu perendamannya tidak kurang dari
48 jam.
3.13 Pemeriksaan Histopatologi Organ Tikus
Pemeriksaan histopatologi organ tikus dengan pembuatan preparat histopatologi dengan pewarnaan Haematoxyllin-Eosin. Proses pembuatan preparat
histopatologi dan pewarnaan Haematoxyllin-Eosin :
a. Penyiapan organ jantung untuk dipotong
Jaringan yang akan dibuat sediaan histopatologi difiksasi dalam larutan Buffer Netra l Forma lin
BNF 10 minimal 48 jam hingga mengeras matang. Sampel organ yang terfiksasi dengan sempurna ditrimming setebal ± 0,5 cm.
Potongan kemudian dimasukkan dalam tissue cassette untuk dimasukkan dalam a utoma tic tissue processor
. b.
Dehidrasi Proses dehidrasi dimaksudkan untuk menarik air dari jaringan dan
mencegah terjadinya pengerutan sampel yang akan diuji. Dehidrasi dilakukan dengan cara merendam sampel dalam larutan alkohol dengan konsentrasi
bertingkat 70, 80, 90, 95, dan alkohol absolut. Proses perendaman masing-masing konsentrasi alkohol dilakukan selama 2 jam. Proses dehidrasi
dilakukan dengan menggunakan mesin otomatis yaitu automatic tissue processor .
Universitas Sumatera Utara
31 c. Clearing
Proses clearing atau penjernihan dilakukan dengan 2 tahap dengan menggunakan xylol I dan xylol II. Penggunaan xylol dimaksudkan untuk
melarutkan alkohol dan parafin. d. Infiltrasi
Infiltrasi dan impregnasi adalah proses pengisian parafin kedalam pori-pori jaringan. Pengisian pori-pori ini dimaksudkan untuk mengeraskan jaringan agar
mudah dipotong dengan pisau mikrotom. Parafin yang digunakan adalah parafin histoplast®.
e. Embedding dan Blocking Embedding
atau blocking adalah proses penanaman jaringan dalam blok parafin. Parafin yang digunakan parafin histoplast. Proses embedding dilakukan
dengan menggunakan alat tissueembedding console. f. Sectioning
Sectioning adalah proses pemotongan jaringan dengan menggunakan
mikrotom dengan ketebalan 2-3 µ m. Pemotongan dilakukan dengan alat rotary microtom
. Dimasukkan ke dalam waterbath, agar parafin mencair dari dalam organ yang telah dipotong, kemudian organ diambil menggunakan object glass
dan disimpan dalam inkubator dengan suhu 37
o
C selama 24 jam. g. Pewarnaan Haematoxyllin-Eosin
Sebelum melakukan pewarnaan, preparat histopatologi dideparafinisasi dengan larutan xylol I dan II selama 2 menit. Kemudian dilakukan proses
rehidrasi dengan cara mencelupkan sediaan ke dalam alkohol bertingkat alkohol absolut, alkohol 95, alkohol 90, alkohol 80. Perendaman dalam alkohol95
Universitas Sumatera Utara
32 dan 80 dilakukan selama 1 menit. Kemudian sediaan dicuci dengan air yang
mengalir air kran selama 1 menit. Sediaan diwarnai dengan pewarna Mayer’s
Ha ema toxyllin dengan tahapan sebagai berikut :
i.preparat direndam dalam larutan Mayer’s Haematoxyllin selama 8 menit
ii.dicuci dengan air mengalir air kran selama 30 detik iii.dicelupkan ke dalam larutan Lithium Carbonat selama 15-30 detik
iv.dicuci dengan air mengalir air kran selama 2 menit v.direndam dalam larutan Eosin selama 2-3 menit
vi.dicuci dengan air mengalir air kran selama 30-60 detik vii.preparat dicelupkan ke dalam larutan alkohol 95 dan alkohol absolut
viii.sebanyak 10 kali celupan, absolut I selama 2 menit, xylol I selama 1 menit dan xylol II selama 2 menit
ix.setelah pewarnaan, sediaan ditetesi perekat Canada balsem Entellan® dan ditutup dengan cover glass.
x.diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya.
3.14Analisis Data
Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan SPSS 18. Data dianalisis dengan menggunakan uji one way ANAVA untuk menentukan
perbedaan rata-rata antara perlakuan. Jika terdapat berbedaan rata-rata dilanjutkan dengan menggunakan uji post Ducan untuk mengetahui perbedaan jumlah nodul
antar kelompok perlakuan, berdasarkan nilai signifikansi, p 0,05 dianggap signifikan. Hasil analisis data dapat dilihat pada tabel lampiran 20.
Universitas Sumatera Utara
33
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Tumbuhan yang digunakan telah diidentifikasi di Herbarium Bogoriense Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor. Hasil identifikasi tumbuhan yang diteliti
adalah daun bangun-bangun Plectranthus amboinicus Lour. Spreng suku Lamiaceae. Hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 3, halaman 52.
4.2 Skrining Fitokimia Simplisia Daun Bangun-bangun
Hasil skrining fitokimia serbuk simplisia daun bangun-bangun menunjukkan
adanya kandungan
saponin, flavonoid,
glikosida dan
steroidtriterpenoid. Hasil pemeriksaan skrining fitokimia dapat dilihat dari Tabel 4.1.
Tabel 4.1 Hasil Pemeriksaan Skrining Fitokimia Simplisia Daun Bangun-bangun
No Pemeriksaan
Simplisia 1
Alkaloid -
2 Flavonoid
+ 3
Glikosida +
4 Saponin
+ 5
Tanin -
6 Steroidtriterpenoid
+ Keterangan : + = mengandung golongan senyawa
- = tidak mengandung golongan senyawa
4.3 Karakterisasi Simplisiadan Ekstrak EtanolDaun Bangun-bangun
Hasil pemeriksaaan makroskopik Lampiran 4, halaman 53 dari daun bangun-bangun segar menunjukkan daun tunggal, berwarna hijau, helaian daun
Universitas Sumatera Utara
Kategori