BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat-alat yang Digunakan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas, bejana kromatografi Dessaga, blender Philips, eksikator, krus porselin, lampu UV 366
nm Diamond, mikroskop cahaya, neraca kasar Home Line, neraca listrik Vibra AJ, oven Memmert, penangas air Yenaco, rotary evaporator Haake
D1, seperangkat alat penetapan kadar air, seperangkat alat refluks,
spektrofotometer ultraviolet Shimadzu dan tanur. 3.1.2 Bahan-bahan
Bahan tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah umbi dari tumbuhan bawang sabrang Eleutherine palmifolia L. Merr. Bahan kimia yang
digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas proanalisa, yaitu alfa-naftol, aluminium III klorida, ammonium hidroksida, asam asetat, asam asetat
anhidrida, asam borat, asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida, bismut III nitrat, n-butanol, etanol, eter, etilasetat, n-
heksan, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, natrium asetat, natrium hidroksida, raksa II klorida, natrium pikrat, serbuk
magnesium, serbuk zinkum, timbal II asetat dan toluena, air suling, kertas Whatmann No.1 dan No.3.
Universitas Sumatera Utara
3.2 Pengambilan dan Pengolahan Sampel 3.2.1 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan sama dari daerah lain. Sampel yang digunakan
umbi dari tumbuhan bawang sabrang Eleutherine palmifolia L. Merr, yang diambil dari jalan Bunga Rampai V, Kelurahan Simalingkar B, Kecamatan Medan
Tuntungan, Kotamadya Medan, Provinsi Sumatera Utara.
3.2.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Indonesian Institute Biologi, Pusat Penelitian Biologi Research Center for
Biology, Bogor.
3.2.3 Pengolahan Sampel
Umbi dari tumbuhan bawang sabrang yang segar dibersihkan dari kotoran dengan cara mencucinya dengan air bersih, ditiriskan, kemudian ditimbang,
selanjutnya dirajang tipis dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di udara terbuka, terlindung dari sinar matahari langsung. Sampel dianggap kering bila
sudah rapuh diremas menjadi hancur, selanjutnya ditimbang dan diserbuk dengan menggunakan blender.
Universitas Sumatera Utara
3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.3.1 Pereaksi Asam Klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga 100 ml Depkes, 1979.
3.3.2 Pereaksi Natrium Hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida ditimbang, kemudian
dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Depkes, 1979. 3.3.3 Pereaksi Besi III Klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air hingga 100 ml Depkes, 1989.
3.3.4 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, kemudian sebanyak 2 g iodium dilarutkan dalam larutan kalium
iodida, setelah larut dicukupkan volume dengan air suling hingga 100 ml
Depkes, 1995.
3.3.5 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,85 g bismut III nitrat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 100 ml asam asetat glasial, lalu ditambahkan 40 ml air suling. Pada wadah lain
dilarutkan 8 g kalium iodida dalam air suling, kemudian campurkan kedua larutan sama banyak, lalu ditambahkan 20 ml asam asetat glasial dan diencerkan dengan
air suling hingga volume 100 ml Zweig, 1987.
3.3.6 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,359 g raksa II klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida
Universitas Sumatera Utara
lalu dilarutkan dalam 10 ml air suling. Kemudian keduanya dicampur dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes, 1989.
3.3.7 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g alfa naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 ml Depkes, 1979.
3.3.8 Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 N
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml Depkes, 1989.
3.3.9 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrid dicampurkan dengan 1 bagian asam sulfat pekat Harborne, 1987.
3.3.10 Pereaksi Kalium Hidroksida 10
Sebanyak 10 g kalium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam etanol hingga 100 ml Wagner, 1984.
3.3.11 Pereaksi Aluminium klorida 5
Sebanyak 5 g aluminium klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam metanol hingga 100 ml Depkes, 1989.
3.3.12. Pereaksi Asam sulfat 2 N
Asam sulfat pekat sebanyak 18 ml diencerkan dengan air suling secukupnya hingga volume 100 ml Depkes, 1989.
3.3.13. Fase gerak Butanol-Asam asetat-Air BAA
Sebanyak butanol 20 ml, asam asetat 5 ml, air suling 25 ml, diambil lapisan atas. Perbandingan fase gerak untuk BAA yaitu 4: 1: 5 Markham, 1988.
Universitas Sumatera Utara
3.3.14. Fase gerak Forestal
Sebanyak 30 ml asam asetat, air suling 10 ml, dan asam klorida 3 ml. Perbandingan fase gerak 30: 10: 3 Markham, 1988.
3.3.15. Pereaksi Asam asetat 50
Asam asetat sebanyak 50 ml diencerkan dalam air suling hingga 100 ml, dibiarkan selama 12 jam Markham, 1988.
3.3.16. Pereaksi Asam asetat 15
Asam asetat sebanyak 15 ml diencerkan dalam air suling hingga 100 ml, dibiarkan selama 5 jam Markham, 1988.
3.3.17. Pereaksi Asam klorida 1
Asam klorida pekat sebanyak 2,7 ml diencerkan dalam air suling hingga 100 ml, dibiarkan selama 5 jam Markham, 1988.
3.4 Pemeriksaan Makroskopik Umbi Bawang Sabrang 3.4.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar dari simplisia umbi dari tumbuhan bawang sabrang Eleutherine palmifolia L. Merr.
3.5 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia 3.5.1 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi destilasi toluen. Dimasukkan 200 ml toluen dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bulat,
lalu didestilasi selama 2 jam. Setelah itu, toluen didinginkan selama 30 menit, dan
Universitas Sumatera Utara
dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml. Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang
seksama, dimasukkan kedalam labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur sebanyak 2 tetes untuk tiap detik sampai
sebagian besar air terdestilasi, selanjutnya diatur 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi
dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan
ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen
World Health Organization, 1992.
Kadar air =
100 x
sampel berat
awal volume
akhir volume
−
3.5.2 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam campuran 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam
labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering
dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara Depkes, 1989.
Kadar sari larut dalam air =
100 x
20 100
x g
sampel berat
g sari
berat
Universitas Sumatera Utara
3.5.3 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 95 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam,
kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan
dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol 95 dihitung terhadap bahan
yang telah dikeringkan diudara Depkes, 1989. Kadar sari larut dalam etanol =
100 x
20 100
x g
sampel berat
g sari
berat
3.5.4 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara lebih dahulu, kemudian diratakan. Krus
dipijarkan pada suhu 600ºC selama 3 jam, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu serbuk simplisia dihitung terhadap bahan
yang telah dikeringkan Depkes, 1989. Kadar abu total =
100 x
g sampel
berat g
abu berat
3.5.5 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida 2 N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam
asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, kemudian dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan pada suhu 600ºC sampai
Universitas Sumatera Utara
bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan Depkes, 1989.
Kadar abu tidak larut dalam asam =
100 x
g sampel
berat g
abu berat
3.6 Skrining Fitokimia 3.6.1 Pemeriksaan Alkaloid
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: i. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
ii. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff iii. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat
Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari tiga percobaan diatas Depkes, 1995.
3.6.2 Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang kemudian ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama 10 menit, disaring panas-panas melalui kertas saring.
Filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling. Setelah dingin ditambahkan 5 ml eter minyak tanah, dikocok hati-hati, lalu diamkan sebentar. Lapisan metanol diambil,
diuapkan pada temperatur 40ºC, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etilasetat, disaring. Filtratnya digunakan untuk uji flavonoid dengan cara berikut:
i. Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml etanol 95 , kemudian ditambah 0,5 g serbuk Zn dan 2 ml asam klorida 2 N,
didiamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida
Universitas Sumatera Utara
pekat. Jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoid.
ii. Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml etanol 95 , lalu ditambah 0,1 g serbuk Mg dan 10 tetes asam klorida pekat.
Jika terjadi warna merah jingga sampai warna merah ungu menunjukkan adanya flavonoid Depkes, 1989.
3.6.3 Pemeriksaan Glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia ditimbang kemudian disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks
selama 1 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu
disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang-ulang sebanyak 3 kali. Kumpulan sari air diuapkan pada
temperatur tidak lebih dari 50 C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa dimasukkan dalam tabung reaksi, selanjutnya diuapkan diatas penangas air.
Sisa dilarutkan dalam 2 ml air suling dan 5 tetes pereaksi molish, kemudian secara perlahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Glikosida
positif jika terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan Depkes, 1995.
3.6.4 Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0.5 g serbuk simplisia ditimbang dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan kemudian dikocok
kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida
2 N menunjukkan adanya saponin Depkes, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.6.5 Pemeriksaan Glikosida Antrakuinon
Sebanyak 0.2 g serbuk simplisia tambahkan dengan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen, dikocok dan didiamkan.
Lapisan benzen dipisahkan dan disaring. Kocok lapisan benzen dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzen tidak
berwarna menunjukkan adanya antrakuinon Depkes, 1989.
3.6.6 Pemeriksaan Glikosida Sianogenik
Sebanyak 0.5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam erlenmeyer, dilembabkan dengan air suling. Diselipkan kertas saring yang telah dibasahi
natrium pikrat pada mulut erlenmeyer, ditutup, dibiarkan terkena sinar matahari. Jika kertas saring memberikan warna merah, menunjukkan adanya sianogenik
glikosida Depkes, 1989.
3.6.7 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0.5 g serbuk simplisia ditimbang, dididihkan selama 3 menit dalam 10 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Filtrat diencerkan dengan air
suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml larutan lalu ditambahkan 1- 2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau
kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966 3.6.8 Pemeriksaan TerpenoidSteroid
Sebanyak 1 g serbuk simplisia ditimbang, dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dan dimasukkan kedalam 2
lubang pelat tetes masing-masing 3 tetes, kemudian menambahakan setetes asam sulfat pekat dan setetes asam asetat anhidrida kedalam masing-masing pelat tetes,
terbentuk warna hijau pada pelat tetes yang ditambahkan setetes asam sulfat dan
Universitas Sumatera Utara
asam asetat anhidrida menandakan adanya steroid, sedangkan bila terbentuk warna merah atau merah ungu menandakan adanya terpenoid Harborne, 1987.
3.7 Pembuatan Ekstrak
Sebanyak 650 g serbuk simplisia dimasukkan kedalam wadah berwarna gelap, dimaserasi dengan pelarut etanol 80 sampai serbuk terendam sempurna
Farnsworth, 1966. Kemudian ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil sesekali diaduk, disaring dan dipisahkan ampasnya Depkes,
1986. Kemudian ampas ditambahkan cairan penyari sampai terendam sebanyak 500 ml, kemudian dilakukan perlakuan yang sama sampai diperoleh maserat
jernih. Seluruh maserat digabungkan dan diuapkan menggunakan alat penguap dengan bantuan alat rotary evaporator pada temperatur tidak lebih dari 40
°C sampai diperoleh ekstrak kental
Bagan Kerja Ekstraksi Serbuk Simplisia Umbi bawang Sabrang
Dimaserasi dengan etanol 80 selama
5 hari diulangi
sampai diperoleh maserat
jernih
Dipekatkan dengan rotary evaporator hingga kental Simplisia Umbi bawang sabrang
Maserat Ampas
Ekstrak etanol kental
- Pemeriksaan makroskopik - PK Air
- PK Sari yang Larut dalam Air - PK Sari yang Larut dalam
Etanol - PK Abu
- PK Abu yang Tidak Larut
Skrining Fitokimia
Universitas Sumatera Utara
3.8 Isolasi Senyawa Flavonoid dari Ekstrak Etanol
