29
3. METODOLOGI PENELITIAN SECARA UMUM
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dimulai bulan Maret 2009 sampai dengan bulan April 2011. Penelitian dilakukan di Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Laboratorium South East Asian Food Agricultural Science Technology SEAFAST Centre
IPB serta Laboratorium pendukung seperti Labotarorium Balitnak Kementerian Pertanian dan
Laboratorium Biorin-Bioteknologi IPB.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan meliputi: otoklaf, mikroskop polarisasi Olympus C-35AD-4 Japan, spektrofotometer, difraksi sinar X Shimadzu XRD-7000
Maxima, gas kromatografi Chrompack CP 9002 seri 946253, anoxomat, anaerobic jar
, sentrifuse, elektroforesis, UV transilluminator, alat PCR PTC 100 MJ Research, Inc, inkubator, otoklaf, oven dan lain sebagainya.
Bahan baku yang digunakan adalah pisang var agung semeru Musa paradisiaca
formatypica yang diperoleh dari Kecamatan Senduro Kabupaten Lumajang Propinsi Jawa Timur. Buah pisang tua mentah dipanen pada minggu ke
16 dari awal pembungaan. Media dan bahan kimia yang digunakan antara lain: de Mann Rogosa Sharp
Agar MRSA dan de Mann Rogosa Sharp Broth MRSB, Brain Heart Infusion
BHI agar, Thioglycollate agar, kristal violet, lugol, safranin, alkohol, NaCl, asam tartarat 10, gliserol, NaOH, buffer fosfat, buffer TAE, Na
2
HPO
4
.2H
2
O, NaHPO
4
, CaCl
2
.2H
2
O, MgCl
2
.6H
2
O, DNS, HCl, K
2
HPO
4
, MgSO
4
.
7H
2
O, CaCl
2
.
2H
2
O, NaHCO
3
, bacto agar, L-cysteine HCl, garam bile, resazurin, vitamin K1, Tween 80, hemin, Kit API 50CH, CTAB, PCI, primer universal 63F dan
1387R KI
2
, enzim pankreatin, pepsin dan amiloglukosidase.
30
Tahap Penelitian
Penelitian meliputi empat tahap yaitu: 1 proses modifikasi secara fermentasi spontan serta kombinasinya dengan satu dan dua siklus pemanasan
bertekanan yang dilanjutkan dengan pendinginan, 2 identifikasi fenotip dan genotip bakteri asam laktat BAL asal fermentasi spontan pisang var agung
semeru, 3 proses modifikasi secara fermentasi oleh isolat BAL indigenus dan kombinasinya dengan siklus pemanasan bertekanan-pendinginan dalam
pembuatan tepung pisang kaya RS, 4 isolasi pati resisten RS serta evaluasi sifat prebiotik dan nilai indeks glikemik tepung pisang.
Modifikasi Pembuatan Tepung Pisang secara Fermentasi Spontan dan Kombinasinya dengan Siklus Pemanasan Bertekanan-Pendinginan
Proses modifikasi dilakukan pada irisan pisang yaitu pisang diiris dengan ketebalan ± 5mm. Irisan pisang diberi perlakuan fermentasi spontan yang
dilanjutkan dengan satu atau dua siklus retrogradasi yaitu pemanasan bertekanan yang diikuti pendinginan. Proses pemanasan bertekanan dilakukan dengan
menggunakan otoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit yang kemudian didinginkan pada suhu 4
o
C selama 24 jam. Tepung pisang kontrol disiapkan tanpa modifikasi yaitu pisang diiris dengan ketebalan ± 5mm dan dikeringkan
pada suhu 50
o
C selama 16 jam selanjutnya dihaluskan serta diayak dengan ayakan 80 mesh.
Tepung pisang modifikasi secara fermentasi spontan yang dikombinasi dengan retrogradasi disiapkan dengan merendam irisan pisang dalam akuades
steril 3:4 dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar. Selama fermentasi dilakukan pengukuran total bakteri asam laktat, pH dan total asam laktat tertitrasi
pada jam ke-0, 12 dan 24 jam. Pada jam ke-24 pisang ditiriskan. Untuk modifikasi fermentasi spontan maka irisan pisang terfermentasi dapat langsung
dikeringkan pada suhu 50
o
C selama 16 jam serta dihaluskan dan diayak dengan ayakan 80 mesh. Untuk modifikasi fermentasi spontan yang dikombinasi dengan
31 siklus pemanasan bertekanan-pendinginan maka irisan pisang terfermentasi diberi
perlakuan satu dan dua siklus pemanasan bertekanan-pendinginan. Perlakuan diulang sebanyak dua kali dengan dua kali ulangan teknik sampling bahan baku di
lahan budidaya pisang var agung semeru. Keenam jenis tepung pisang yang dihasilkan selanjutnya dianalisis
komposisi kimia yang meliputi proksimat air, protein, lemak, mineral dan karbohidrat dengan menggunakan metode AOAC 1999, kadar pati dan kadar
amilosa AACC 2000, pati cepat tercerna rapidly digestible starchRDS, pati lambat tercerna slowly digestible starchSDS, pati resisten resistant starchRS
Englyst et al. 1992, serta daya cerna AACC 2000. Karakterisasi fisik seperti bentuk granula pati dan tingkat kristalinitas tepung pisang juga dievaluasi pada
tepung pisang kontrol dan tepung pisang modifikasi yang banyak mengandung pati resisten.
Identifikasi Fenotip dan Genotip Bakteri Asam Laktat Asal Fermentasi Spontan Pisang var Agung Semeru
Selama fermentasi spontan 24 jam diketahui populasi bakteri asam laktat BAL tumbuh dominan. Oleh karena itu dilakukan identifikasi BAL yang
berperan selama fermentasi. Identifikasi fenotip berdasarkan sifat Gram positif, katalase negatif, bentuk sel kokus atau batang dengan bentuktipe koloni tertentu
Ammor et al. 2005. Selanjutnya isolat diinokulasikan dalam media MRS cair dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam untuk diidentifikasi lanjut atau disimpan dalam larutan gliserol 30 vv pada suhu -20
o
C. Sifat fermentatif isolat BAL dianalisis dengan menggunakan kit API 50CHL.
Identifikasi genotip dilakukan dengan menggunakan metode PCR dan sekuensing DNA pengkode 16S rRNA. DNA isolat BAL diekstraksi dengan
menggunakan metode Thompson et al. 1995. Amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan alat PCR PTC 100 MJ
Research, Inc pada suhu 95
o
C selama 5 menit, dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 94
o
C selama 30 detik kemudian 30 siklus penempelan primer pada suhu 50
o
C selama 1 menit, 72
o
C selama 2 menit, dan tahap akhir pasca sintesis
32 pada suhu 72
o
C selama 5 menit dan 15
o
C selama 10 menit. Produk PCR diambil dan disimpan pada suhu 4
o
C untuk selanjutnya diperiksa dengan menggunakan elektroforesis agarosa 1 bv dalam TAE 1x, 100 V selama 30 menit Sambrook
dan Russel 2008; Suharsono dan Widyastuti 2008. Pensejajaran ganda multiple alignment
dilakukan dengan menggunakan Program Clustal W yang selanjutnya divisualisasikan kekerabatannya menggunakan pohon filogenetik Program
TREEVIEW X yang dikombinasikan dengan Program NJ-Plot Thompson et al. 1995.
Modifikasi Secara Fermentasi Terkendali oleh Isolat BAL Indigenus dalam Pembuatan Tepung Pisang Modifikasi Kaya RS
Irisan pisang dan akuades steril dalam perbandingan 3:4 diinokulasi dengan isolat BAL homofermentatif indigenus sehingga populasi kultur mencapai jumlah
10
6
CFUml. Selanjutnya pisang diinkubasi selama 12 dan 24 jam pada suhu kamar. Pisang ditiriskan dan diberi proses dua siklus pemanasan bertekanan-
pendinginan yaitu pemanasan bertekanan dengan menggunakan otoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit kemudian dilanjutkan dengan pendinginan pada suhu 4
o
C selama 24 jam. Proses pengeringan dilakukan pada suhu 50
o
C selama 16 jam, selanjutnya chip dihaluskan serta diayak dengan menggunakan ayakan 80 mesh.
Evaluasi Sifat Prebiotik dan Indeks Glikemik IG Tepung Pisang
Evaluasi sifat prebiotik dilakukan pada RS2 dari tepung pisang yang tidak mengalami retrogradasi dan RS3 dari tepung pisang yang mengalami retrogradasi.
RS diisolasi dengan menggunakan metode Englyst et al. 1992 yang dimodifikasi dengan metode gravimetri AOAC 1999. Sifat prebiotik dianalisis berdasarkan
ketahanan RS terhadap cairan lambung artifisial pada pH 1 sampai 5 Wicheinchot et al. 2010, persentase pertumbuhan probiotik Lactobacillus
acidophilus dan bakteri patogen, yaitu enteropatogenik Escherichia coli EPEC
dan Salmonella Typhimurium Buriti et al. 2010 serta fermentasi RS oleh kultur
33 feses untuk mengetahui kemampuan memodulasi mikroflora dan menstimulasi
produksi asam lemak rantai pendek short chain fatty acidSCFA serta nilai indeks prebiotik Manderson et al. 2005.
Evaluasi IG dilakukan pada keenam jenis tepung pisang yang dihasilkan. Uji IG tepung pisang dilakukan dengan menggunakan sepuluh relawan manusia
Astawan Widowati 2011. Tepung pisang disajikan kepada relawan dalam bentuk nasi yang diolah seperti menanak tiwul. Pengujian ini sudah mendapat
persetujuan etis ethical approval dari Kementerian Kesehatan dengan No. LB.03.04KE8320 2010.
34
DAFTAR PUSTAKA
[AACC] American Association of Cereal Chemists. 2000. Approved Methods of the AACC. The Association, St. Paul, MN. 10
th
ed. Ammor S, Rachman C, Chaillou S, Prevost H, Dousset X, Zagorec M, Dufour E,
Chevalliera I. 2005. Phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria isolated from a small-scale facility producing traditional dry
sausages. J Food Microbiol. 22: 373–382
[AOAC] Association of analytical communities. 1999. Official Methods of Analysis of AOAC International
16th
. USA. Astawan M, Widowati S. 2011. Evaluation of nutrition and glycemic index of
sweet potatoes and its appropriate processing to hypoglycemic foods. Indonesian J Agricultural Science
. 12 1 Buriti FCA, Castro IA, Saad SMI. 2010. Viability of Lactobacillus acidophilus in
synbiotic guava mousses and its survival under in vitro simulated gastrointestinal conditions. Int J Food Microbiology. 137: 121–129.
Englyst HN, Kingman SM, Cummings JH. 1992. Classification and measurement of nutritionally important starch fraction. European J Clinical Nutr.
46Suppl.2: 533-550. Manderson K, Pinar M, Tuhoy KM, Race WE, Otckiss AT, Widmer W, Yadhav
MP, Gibson R, Rastall RS. 2005. In vitro determination of prebiotic properties of oligosaccharides derived from an orange juice manufacturing
by-product stream. App and Env Microbiol. 71 12: 8383-8389,
Suharsono, Widyastuti U. 2008. Penuntun Praktikum; Pengantar Genetika Molekuler. Departemen Biologi-FMIPA. Institut Pertanian Bogor
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1995. CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting, Position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acid Res.
22: 4673-4680. Wichienchot S, Jatupornpipat M, Rastall RA. 2010. Oligosaccharides of pitaya
dragon fruit flesh and their prebiotic properties. Food Chem. 120: 850– 857.
35
4. KARAKTERISTIK FISIKOKIMIA TEPUNG PISANG TERMODIFIKASI SECARA FERMENTASI SPONTAN DAN
Kategori