IDENTIFIKASI FENOTIP DAN GENOTIP BAKTERI ASAM LAKTAT YANG BERPERAN SELAMA FERMENTASI

53

5. IDENTIFIKASI FENOTIP DAN GENOTIP BAKTERI ASAM LAKTAT YANG BERPERAN SELAMA FERMENTASI

SPONTAN PISANG VAR AGUNG SEMERU Musa paradisiaca formatypica [ Phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria during spontaneous fermentation of unripe var agung semeru banana Musa paradisiaca formatypica] ABSTRAK Fermentasi spontan pada suhu kamar selama 24 jam dilakukan dalam pembuatan tepung pisang kaya pati resisten. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa bakteri asam laktat BAL merupakan bakteri yang mendominasi selama fermentasi spontan pisang var agung semeru Musa paradisiaca formatypica. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi fenotip dan genotip BAL indigenus pisang. Identifikasi fenotip dilakukan berdasarkan morfologi umum, uji fisiologi dan biokimiawi menggunakan kit API analytical profile index. Identifikasi genotip dilakukan dengan menggunakan PCR dan analisis sekuen DNA pengkode 16S rRNA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa BAL yang tumbuh memiliki karakteristik sel bentuk batang yang tumbuh optimal pada suhu 35 o C dan memiliki kemampuan memfermentasi D-ribosa, D-xilosa, D-glukosa, D-fruktosa, D-manosa, N-asetil glukosamin, arbutin, eskulin feri sitrat, salisin, D- seliobiosa, D-maltosa, D-sukrosa dan gentiobiosa. Isolat BAL FSnh1 juga mampu menggunakan D-galaktosa, L-sorbosa, L-rhamnosa, amigdalin dan kalium glukonat, sedangkan isolat FSnhA juga mampu menggunakan gliserol, metil αD- glukopiranosa, D-laktosa, D-meliobiosa, D-trehalosa dan D-turanosa sebagai sumber karbon. Identifikasi genotip menunjukkan bakteri asam laktat FSnh1 dan FSnhA termasuk famili Lactobacillaceae dengan genus Lactobacillus. Hasil analisis pohon filogenetik menunjukkan isolat BAL FSnh 1 memiliki similaritas dengan L. salivarius dan isolat BAL FSnh A memiliki similaritas dengan L. fructivorans . ABSTRACT Spontaneous fermentation at room temperature for 24 h was conducted in the resistant starch-rich banana flour production. The investigation showed that lactic acid bacteria LAB were the dominating bacteria during spontaneous fermentation of unripe var agung semeru banana Musa paradisiaca formatypica. The objectives of the research were to identify the LAB phenotypic and genotypic. Phenotypic identification was based on general morphology, physiological test, and biolochemical test using API Analytical Profile Index kit. Genotypic identification was conducted by using polymerase chain reaction PCR and analyses of 16S rRNA sequence. The result showed that LAB are the predominant species as Gram-positive rod and have ability to ferment D-ribose, 54 D-xilose, D-glucose, D-fructose, D-mannosa, N-acetyl glucosamin, arbutin, esculin fericitrat, salicin, D-celiobiose, D-maltose, D-saccarose and gentiobiose as carbon source. Beside that FSnh1 isolate able to ferment D-galactose, L- sorbose, L-rhamnose, amygdalin and kalium gluconat, while FSnhA isolate used glycerol, metil αD-glucopyranosid, D-lactose, D-meliobiose, D-trehalose and D- turanose as carbon source. The genotypic identification showed that Lactobacillus sp associated with the spontaneous fermentation of var agung semeru banana were identified as L. salivarius and L. fructivorans. Keywords: Musa paradisiaca formatypica, phenotypic-genotypic identification, Lactobacillus salivarus, Lactobacillus fructivorans PENDAHULUAN Salah satu proses modifikasi tepung pisang adalah fermentasi spontan yang dikombinasi dengan pemanasan bertekanan-pendinginan. Proses ini mampu meningkatkan kandungan RS3 pada tepung pisang. Selama fermentasi spontan dilaporkan bakteri asam laktat BAL yang tumbuh dominan hingga jam ke-100 Jenie et al. 2009; Abdillah 2010. Akan tetapi BAL yang tumbuh belum diidentifikasi fenotip dan genotipnya. Fermentasi yang terjadi secara spontan tidak dapat digunakan untuk menjaga mutu produk yang dihasilkan. Penggunaan kultur starter indigenus dari bahan aslinya akan memudahkan dalam mengendalikan proses fermentasi serta memberikan hasil fermentasi yang lebih baik dan sesuai dengan karakteristik produk yang diinginkan. Fermentasi urutan sosis daging babi sebagai makanan khas Bali menggunakan starter L. plantarum dan Pediococcus acidilactici yang diisolasi dari urutan tradisional fermentasi spontan serta mampu menghasilkan karakteristik sosis yang lebih baik daripada urutan hasil fermentasi spontan Antara et al. 2002; Antara 2010. Oleh karena itu isolasi dan identifikasi BAL dari strain indigenus sangat penting dilakukan untuk mengembangkan produk pangan lokal. Identifikasi BAL dapat dilakukan berdasarkan fenotip dan genotip. Identifikasi fenotip didasarkan pada hasil pengamatan morfologi seperti bentuk sel dan pewarnaan Gram, uji fisiologis, metabolik biokimia atau kemotaksonomi. Identifikasi genotip dapat dilakukan dengan menggunakan metode molekuler 55 yaitu sekuensing gen pengkode 16S rRNA bakteri dengan metode Polymerase Chain Reactions PCR-sekuensing Ammor et al. 2005. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi fenotip dan genotip BAL yang diisolasi dari fermentasi spontan pisang var agung semeru Musa paradisiaca formatypica. Pisang tersebut merupakan jenis pisang plantain yang banyak dibudidayakan di Kabupaten Lumajang Propinsi Jawa Timur dengan tingkat produksi dapat mencapai lebih dari 57 ribu ton per tahun RPJMD Lumajang 2009. BAHAN DAN METODE Bahan Pisang var agung semeru Musa paradisiaca formatypica diperoleh dari Desa Burno dan Desa Kandang Tepus Kecamatan Senduro Kabupaten Lumajang Propinsi Jawa Timur. Pisang yang digunakan berumur 16 minggu dari awal pembungaan yang memiliki tingkat kematangan tahap 1 yaitu pisang tua dengan kulit hijau merata. Primer universal 16S rRNA adalah 63F dan 1387R yang diperoleh dari PT. Genetika Science of Indonesia order ID: 82804-2028 Metode Isolasi Bakteri Asam Laktat Pisang dikupas dan diiris melintang membentuk lembaran dengan ketebalan sekitar 5 mm. Sebanyak 750 g irisan pisang dimasukkan ke dalam erlenmeyer berisi 1000 mL akuades steril dan diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Selanjutnya 10 mL air rendaman diambil dan dilakukan pengenceran hingga 10 -3 kemudian dilakukan pemupukan pada media de Mann Rogosa Sharp MRS agar dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama dua hari. Koloni tunggal dimurnikan dengan goresan kuadran selanjutnya dikelompokkan berdasarkan bentuk koloni, sifat Gram positif, katalase negatif, dan bentuk morfologi kokus atau batang. 56 Isolat diinokulasikan dalam media MRS cair dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Isolat sebelum digunakan dapat disimpan dalam sediaan gliserol 30 vv pada suhu -20 o C. Identifikasi Fenotip Menggunakan API 50CHL API-Biomerieux Isolat BAL diinokulasikan pada media MRS agar dengan metode gores dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Kultur dipersiapkan dengan mengambil isolat dan dimasukkan ke dalam 10 mL medium suspensi API Analytical Profile Index. Lubang pada tatakan plastik diberi akuades steril ± 1 ml, selanjutnya 1 mL kultur diteteskan pada 50 microtube API 50CHL yang berisi 49 jenis gula, dan pada bagian atas ditutup dengan 1ml parafin cair steril. Kit API 50CHL diinkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam. Terjadinya perubahan warna dari biru menjadi hijau hingga kuning atau hitam dinyatakan sebagai uji positif. Selanjutnya profil isolat dianalisis dengan menggunakan Program APIWEB TM untuk mengetahui identitas kedekatannya genus dan spesies. Identifikasi Genotip Menggunakan PCR dan Analisis Urutan DNA Pengkode 16S rRNA Identifikasi genotip dilakukan dengan mengekstrak DNA pengkode 16S rRNA yang selanjutnya diamplifikasi dan dilakukan sekuensing. Ekstraksi DNA genomik menggunakan Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide CTAB. Sebanyak 1.5 mL kultur dalam tabung eppendorf disentrifus 5000 rpm, 7 menit dan supernatan dibuang sedangkan pelet ditambah 1 mL akuabides steril yang selanjutnya disentrifus lagi. Pelet ditambah 600 µL buffer CTAB 1.5 CTAB, 75 mM Tris HCL, pH 8.0, 15 mM EDTA, 1.05 M NaCl yang mengandung polivinilpirolidon 2 dan dicampur hingga merata kemudian diinkubasi pada suhu 65 o C selama 30 menit. Inkubasi dilanjutkan dalam balok es selama 5 menit yang kemudian ditambah 600 µL PCI fenol-klorofom-isoamil dan dibolak balik serta disentrifus 10.000 rpm, suhu ruang, 10 menit. Supernatan ditambah 600 µL 57 PCI fenol-klorofom-isoamil dan dibolak balik, selanjutnya disentrifus lagi 10.000 rpm, suhu ruang, 10 menit. Supernatan diambil dan ditambah 2M Na- asetat pH 5.2 0.1 x volume dan etanol murni 2 x volume kemudian disimpan dalam freezer selama 2 jam. Selanjutnya larutan tersebut disentrifus 10.000 rpm, 4 o C, 20 menit. Pelet dibilas dengan etanol 70 500 µL dan disentrifus 10.000 rpm, 4 o C, 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan dengan pengering vakum 37 - 40 o C selama 15 menit. Ekstrak DNA ditambah 15 µL akuabides dan 6 µL RNAase 100 µgmL serta dipanaskan pada suhu 70 o C selama 10 menit. Visualisasi DNA dilakukan pada gel agarosa 1.5 dalam larutan 1mM TAE Tris Asetat EDTA 1 X. Pita-pita DNA diamati di bawah UV transilluminator GelDoc Labquip dan difoto dengan kamera UV Canon 1200 Thompson et al. 1995; Suharsono dan Widyastuti, 2008. Amplifikasi DNA Pengkode 16S rRNA dengan PCR Polymerase Chain Reaction Reaksi amplifikasi sampel DNA dilakukan dalam 0.2 mL tabung PCR. Pada setiap tabung reaksi PCR ditambahkan RBC Taq 5 unitmL sebanyak 0.25 μL, 10 x buffer Taq mengandung Mg 2+ sebanyak 5 μL, dNTP 2.5mM sebanyak 4 μL, primer universal 63F 5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’ dan primer universal 1387R 5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’ sebanyak masing-masing 1.25 μL 20 pmol dan 1.25 μL 20 pmol, ekstrak genom sebanyak 2.5 μL 100 ng dan ditambah ddH2O sampai volume menjadi 50 μL. Amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan alat PCR PTC 100 MJ Research, Inc pada suhu 95 o C selama 5 menit, dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 94 o C selama 30 detik kemudian 30 siklus penempelan primer pada suhu 50 o C selama 1 menit, 72 o C selama 2 menit, dan tahap akhir pasca sintesis pada suhu 72 o C selama 5 menit dan 15 o C selama 10 menit. Produk PCR diambil dan disimpan pada suhu 4 o C untuk selanjutnya diperiksa dengan menggunakan elektroforesis agarosa 1 bv dalam TAE 1x, 100 V selama 30 menit Sambrook dan Russel 2008; Suharsono dan Widyastuti 2008. 58 Analisis Urutan DNA Pengkode 16S rRNA Sekuensing DNA pengkode 16S rRNA dilakukan oleh 1 st Base Singapura melalui PT. Genetika Science of Indonesia. Analisis hasil sekuensing dilakukan dengan memBLAST urutan nukleotida dari hasil sekuensing DNA pengkode 16S rRNA dengan data base yang tersedia pada situs www.ncbi.nlm.hts.nih . Pensejajaran ganda multiple alignment dilakukan dengan menggunakan Program Clustal W. Selanjutnya visualisasi kekerabatan menggunakan pohon filogenetik Program TREEVIEW X dengan Neighbor-Joining plot Thompson et al. 1995. HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik Fenotip Bakteri Asam Laktat Bakteri asam laktat BAL yang diisolasi memiliki karakteristik morfologi yaitu bentuk selnya batang dan tumbuh optimal pada suhu 35 o C. Karakteristik BAL yang tumbuh dapat dilihat pada Tabel 5.1. Dua belas isolat dikelompokkan menjadi dua kelompok berdasarkan kesamaan morfologi, sifat homofermentatif atau heterofermentatif dan suhu pertumbuhannya. BAL yang tumbuh lebih dominan FSnh1-10 memiliki ciri yaitu koloni bulat sedang, berwarna putih susu dengan elevasi cembung, tidak membentuk gas dan dapat tumbuh pada suhu 45 o C tetapi tidak tumbuh pada suhu 15 o C. BAL yang tumbuh kurang dominan FSnhA-B memiliki ciri yaitu koloni bulat kecil berwarna putih bening dengan elevasi seperti tetesan, membentuk gas dan dapat tumbuh pada suhu 15 o C dan 45 o C. Identifikasi lanjut seperti uji fermentatif menggunakan kit API 50 CHL dan identifikasi genotip berdasarkan gen pengkode 16S rRNA dilakukan pada dua kelompok yang diwakili oleh isolat BAL FSnh1 untuk BAL homofermentatif yang tumbuh dominan dan isolat BAL FSnhA untuk BAL heterofermentatif yang tumbuh kurang dominan. 59 Tabel 5.1 Karakteristik bakteri asam laktat yang diisolasi dari fermentasi spontan pisang var agung semeru No Isolat BAL Karakteristik Gram Gas Katalase Bentuk Sel Tipikal koloni Suhu Pertumbuhan 15 o C 35 o C 45 o C 1 FSnh1 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung - +++ ++ 2 FSnhA + + - Batang Bulat kecil berwarna putih bening dengan elevasi seperti tetesan + +++ ++ 3 FSnh2 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung - +++ ++ 4 FSnh3 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung - +++ ++ 5 FSnh4 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung - +++ ++ 6 FSnh5 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung - +++ ++ 7 FSnh6 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung - +++ ++ 8 FSnh7 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung - +++ ++ 9 FSnh8 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung - +++ ++ 10 FSnhB + + - Batang Bulat kecil berwarna putih bening dengan elevasi seperti tetesan + +++ ++ 11 FSnh9 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung. - +++ ++ 12 FSnh10 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung. - +++ ++ Kedua isolat BAL tersebut isolat BAL FSnh1 dan isolat BAL FSnhA pada substrat gula kit API 50CHL menunjukkan pola fermentasi yang berbeda dan mampu memfermentasi gula tertentu sebagai sumber karbon. Pola fermentasi yang dihasilkan oleh isolat FSnh1 dan isolat FSnhA dapat dilihat pada Tabel 5.2. 60 Tabel 5.2 Pola fermentasi isolat BAL FSnh 1 dan isolat BAL FSnh A pada Kit API 50CHL Sumber Karbon Kemampuan Memfermentasi Isolat BAL FSnh1 Isolat BAL FSnhA Gliserol - + D-ribosa + + D-xilosa + + D-galaktosa + - D-glukosa + + D-fruktosa + + D-manosa + + L-sorbosa + - L-rhamnosa + - Metil αD-glukopiranosida - + N-asetil glukosamin + + Amigdalin + - Arbutin + + Eskulin feri sitrat + + Salisin + + D-seliobiosa + + D-maltosa + + D-laktosa - + D-meliobiosa - + D-sukrosa + + D-trehalosa - + Gentiobiosa + + D-turanosa - + Kalium glukonat + - Uji fermentasi pada kit API 50CHL menunjukkan bahwa kedua isolat mampu memfermentasi D-ribosa, D-xilosa, D-glukosa, D-fruktosa, D-manosa, N- asetil glukosamin, arbutin, eskulin feri sitrat, salisin, D-seliobiosa, D-maltosa, D- sukrosa dan gentiobiosa. Selain itu isolat BAL FSnh1 juga mampu memfermentasi D-galaktosa, L-sorbosa, L-rhamnosa, amigdalin dan kalium glukonat, sedangkan isolat BAL FSnhA juga mampu memfermentasi gliserol, metil αD-glukopiranosa, D-laktosa, D-meliobiosa, D-trehalosa dan D-turanosa sebagai sumber karbon. Adanya perbedaan kemampuan memfermentasi sumber karbon tertentu pada kedua isolat BAL yaitu D-galaktosa, L-sorbosa, L-rhamnosa, gliserol, metil αD-glukopiranosa, amigdalin, D-laktosa, D-meliobiosa, D- trehalosa, D-turanosa, dan kalium glukonat menunjukkan fenotip biokimiawi 61 kedua isolat tersebut berbeda. Tamang et al. 2008 melaporkan bahwa identifikasi dengan menggunakan API 50CHL dan karakteristik biologi perlu dilanjutkan dengan identifikasi genotip untuk memperjelas di tingkat strain berdasarkan sekuen DNA pengkode 16S rRNA. Karakteristik Genotip Bakteri Asam Laktat Karakterisasi genotip isolat BAL dilakukan berdasarkan DNA pengkode 16S rRNA untuk menentukan genus dan strainnya. DNA pengkode 16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda molekuler untuk definisi spesies karena molekul ini ada pada setiap bakteri dengan fungsi yang identik pada seluruh bakteri. Oleh karena itu dapat dirancang suatu primer yang universal untuk seluruh kelompok bakteri. Data urutan basa gen penyandi 16S rRNA dapat digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang menunjukkan nenek moyang dan hubungan kekerabatan suatu organisme Ward 1998; Pangastuti 2006. DNA dari isolat BAL FSnh1 dan BAL FSnhA diamplifikasi dengan menggunakan primer 63F dan 1387R, sedangkan marker pita DNA yang digunakan mendekati 1500 pasang basa. Hal ini relevan dengan produk PCR yang dihasilkan yaitu sekitar 1400 pasang basa Gambar 5.1. Gambar 5.1 Hasil elektroforesis agarosa 1 dan amplifikasi DNA pengkode gen 16S rRNA dengan PCR. M = marka DNA 1kb DNAladder. a = BAL FSnh1; b = BAL FSnhA ~ 1400 pb 12000 pb 1650 1000 b M a 62 Hasil pensejajaran sekuen DNA pengkode 16S rRNA menunjukkan isolat BAL FSnh1 dan BAL FSnhA merupakan famili Lactobacillaceae. Hasil Program Clustal W menunjukkan skor kedekatan tertinggi dari kedua isolat tersebut adalah 84 terhadap genus Lactobacillus. Komposisi nukleotida penyusun DNA pengkode 16S rRNA setiap isolat BAL berbeda sehingga dilakukan analisis kekerabatan menggunakan program BLAST-N Basic Local Alignment Search Tool- Nucleotide yang dapat diakses secara online dari website NCBI. Berdasarkan analisis program BLAST-N maka diketahui homologi spesies dari isolat BAL FSnh1 dan isolat BAL FSnhA seperti yang disajikan pada Tabel 5.3. Isolat BAL FSnh1 memiliki kemiripansimilaritas dengan Lactobacillus delbruekci subsp. bulgaricus NDO2 81, L. amylovorus GRL 1112 80 dan L. iners 80 yang masing-masing memiliki query coverage di atas 80. Isolat BAL FSnhA memiliki kemiripan 81 dengan Lactobacillus iners dan L. delbruekci subsp. bulgaricus , serta 80 dengan Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris ATCC 19254. Tabel 5.3 Hasil analisis sekuen DNA pengkode gen 16SrRNA dari isolat BAL FSnh1 dan FSnhA menggunakan program BLAST-N Isolat Spesies Bakteri Asam Laktat Homolog Query Coverage Identitas Maksimal Kode Akses FSnh1 Lactobacillus delbruekci subsp. bulgaricus NDO2 Lactobacillus amylovorus GRL 1112 Lactobacillus iners LEAF 86 86 85 81 80 80 NC 008054.1 ACKV01000113.1 AEKH01000023.1 FSnhA Lactobacillus iners LEAF Lactobacillus delbruekci subsp. bulgaricus NDO2 Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris ATCC 19254 84 85 85 81 81 80 AEKH01000023.1 NC 008054.1 ACKV01000113.1 Hasil analisis kekerabatan dengan program BLAST-N kemudian dilanjutkan dengan analisis pohon filogenetik secara dua tahap menggunakan program TREEVIEW X yang dikombinasikan dengan program NJplot. Tahap pertama 63 mensejajarkan sekuen kedua isolat BAL dengan isolat internasional dari genus yang berbeda dalam satu famili yaitu Lactobacillaceae Gambar 5.2. Gambar 5.2 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen DNA pengkode 16S rRNA isolat BAL FSnh1 dan BAL FSnhA yang dibandingkan dengan sekuen DNA pengkode 16S rRNA bakteri asam laktat genbank dalam satu famili Lactobacillaceae Hasil analisis pohon filogenetik tahap pertama menunjukkan bahwa kedua isolat BAL memiliki skor kesejajaran tertinggi dengan Lactobacillus sebesar 84 dan skor kesejajaran terendah dengan Weisella sebesar 39. Skor kesejajaran antara isolat BAL FSnh1 dan isolat BAL FSnhA sebesar 92 yang menunjukkan bahwa kedua isolat tersebut berada dalam genus yang sama yaitu Lactobacillus. Tahap kedua adalah mensejajarkan kedua isolat BAL dengan isolat internasional dari spesies yang berbeda dalam genus Lactobacillus dari hasil tahap pertama. Hasil analisis pohon filogenetik tahap kedua menggunakan program NJplot menunjukkan bahwa isolat FSnh1 memiliki skor tertinggi sebesar 87 dengan Lactobacillus salivarius ATCC 11741, sedangkan isolat FSnhA memiliki skor tertinggi sebesar 86 dengan Lactobacillus fructivorans Gambar 5.3. L. salivarius dan L. fructivorans memiliki skor kesejajaran sebesar 98 yang menunjukkan kekerabatan yang dekat antara kedua isolat yaitu memiliki genus yang sama Lactobacillus. Leuconostoc Fructobacillus 0.023 0.055 Oenococcus 0.028 0.112 Abiotrophia Aerococcus Eremococcus 0.062 0.050 0.060 0.016 Streptococcus Lactococcus 0.050 0.061 0.030 Enterococcus Granulicatella Carnobacterium 0.038 0.037 0.048 Pediococcus 0.080 0.010 Lactobacillus 0.077 0.009 0.016 FSnh1 FSnhA 0.145 0.032 0.068 0.087 Weis sella 0.192 0.355 0.05 64 Gambar 5.3 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen DNA pengkode 16S rRNA dari isolat BAL FSnh1 dan BAL FSnhA yang dibandingkan dengan sekuen DNA pengkode 16S rRNA bakteri asam laktat genbank dalam satu genus Lactobacillus Berdasarkan hasil identifikasi genotip, fermentasi spontan pisang var agung semeru didominasi oleh BAL genus Lactobacillus sp. Pisang var agung semeru merupakan salah satu jenis pisang olahan plantain yang memiliki kadar pati lebih dari 70 g 100 g tepung yang dihasilkan. Reddy et al. 2008 menjelaskan bahwa Lactobacillus sp juga dapat ditemukan pada produk pangan berpati seperti pada fermentasi singkong, beras, dan gandum. Fermentasi spontan pisang var agung semeru dilakukan secara terendam dalam akuades steril dengan menggunakan erlenmeyer dan ditutup secara aseptis. Kondisi demikian memungkinkan bakteri anaerob fakultatif atau mikroaerofilik seperti L. salivarius dan L. fructivorans yang tumbuh dalam kondisi oksigen terbatas. L. salivarius adalah bakteri gram positif dengan G + C 32.9, batang pleomorfik, anaerob fakultatif, katalase negatif, nonmotil, homofermentatif obligat, tumbuh baik pada suhu 37 o C Stern et al. 2006. Bakteri tersebut hidup di inang seperti pada mulut dan saluran pencernaan mamalia termasuk manusia Mozzi et al. 2010. L.sobrius L.amylovorus L.helveticus 0.008 0.012 L.salivarius L.paracas ei L.fermentum L.vaginalis 0.054 0.060 L.collinoides 0.011 0.050 L.lindneri L.fructivorans 0.029 0.019 0.027 0.076 0.053 0.061 0.008 FSnh1 FSnhA 0.142 0.036 0.094 0.087 L.casei L.rhamnosus 0.114 0.140 L.curvatus 0.177 0.278 0.169 0.044 0.05 65 L. fructivorans merupakan bakteri asam laktat berbentuk batang, dapat tumbuh pada suhu 45 o C, heterofermentatif obligat, dapat membentuk gas dari glukosa dan glukonat Dicks Endo 2009. Hasil BLAST-N isolat FSnhA memiliki kemiripan dengan isolat Leuconostoc mesenteroides hal ini diduga karena L. fructivorans dan L. mesenteroides memiliki sifat yang sama yaitu bersifat heterofermentatif obligat. KESIMPULAN Karakteristik bakteri asam laktat BAL yang tumbuh pada fermentasi spontan pisang 24 jam adalah BAL dengan sel berbentuk batang yang tumbuh optimal pada suhu 35 o C, dapat tumbuh pada suhu 45 dan atau 15 o C dengan tipe koloni bulat kecil – sedang, berwarna putih bening – susu dengan elevasi cembung atau seperti tetesan, homofermentatif atau heterofermentatif. Pola fermentasi kedua isolat adalah berbeda sehingga dilakukan konfirmasi genotip dengan menggunakan PCR dan sekuen DNA pengkode 16S rRNA untuk mengidentifikasi di tingkat strain. Visualisasi genotip pada pohon filogenetik menunjukkan bahwa kedua isolat BAL indigenus pisang adalah Lactobacillus salivarius untuk isolat BAL FSnh1 dan L. fructivorans untuk isolat BAL FSnhA. DAFTAR PUSTAKA Antara NS. 2010. Peran bakteri asam laktat strain lokal untuk memperbaiki mutu dan keamanan produk pangan lokal. [Orasi Ilmiah]. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana. Antara NS, Sujaya IN, Yokota A, Asano K, Aryanta WR, Tomita F. 2002. Identification and succession of lactic acid bacteria during fermentation of ‘urutan’, a Balinese indigenous fermented sausage. World J Microbiol Biotechnol . 18: 255–262, 2002. Ammor S, Rachman C, Chaillou S, Prevost H, Dousset X, Zagorec M, Dufour E, Chevallier I. 2005. Phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria isolated from a small-scale facility producing traditional dry sausages. J Food Microbiol. 22: 373–382 66 Arief II, Jenie BSL, Asyawan M, Witarto AB. 2010. Efektivitas probiotik Lactobacillus plantarum 2C12 dan Lactobacillus acidophilus 2B4 sebagai pencegah diare pada tikus percobaan. J Media Peternakan. 33 3: 137- 143. Bjorkroth KJ, Schillinger U, Geisen R, Weiss N, Hoste B, Holzapfel WH, Korkeala HJ, Vandamme P. 2002. Taxonomic study of Weissella confusa and description of Weissella cibaria sp. nov., detected in food and clinical samples. Int J Systematic and Evolutionary Microbiol. 52; 141–148 Dicks LMT, Endo A. 2009. Taxonomic Status of Lactic Acid Bacteria in Wine and Key Characteristics to Differentiate Species. S. Afr. J Enol. Vitic. 30 1: 72-90 Katina K, Maina NH, Juvonen R, Flander L, Johansson L, Virkki L, Tenkanen M, Laitila A. 2009. In situ production and analysis of Weissella confusa dextran in wheat sourdough. J Food Microbiol. 26: 734–743 Kusumawati N, Jenie BSL, Siswasetyahadi, Hariyadi RD. 2003. Seleksi bakteri asam laktat indigenus sebagai galur probiotik dengan kemampuan menurunkan kolesterol. J Mikrobiologi Indonesia. 8 2: 39-43 Malik A, Ariestanti DM, Nurfachtiyani A, Yanuar A. 2008. Skrining gen glukosiltransferase gtf dari bakteri asam laktat penghasil eksopolisakarida. J Makara Sains . 12 1: 1-6 Mozzi F, Raya RR, Fignolo GM. 2010. Biotecnology of Lactic Acid Bacteria: novel application. Wiley Blackwell Publishing. State Avenue-Ames-Iowa USA. Pangastuti A. 2006. Definisi spesies prokaryota berdasarkan urutan basa gen penyandi 16s rRNA dan gen penyandi protein. J Biodiversitas. 73 : 292- 296. Plessis HW, Dicks LMT, Pretorius IS, Lambrechts MG, Toit MD. 2004. Identification of lactic acid bacteria isolated from South African brandy base wines. Intern J Food Microbiol. 91: 19– 29 Reddy G, Altaf M, Naveena BJ, Venkateshwar M, Kumar EV. 2008. Amylolytic bacterial lactic acid fermentation — A review. J Elsevier- Biotechnol Adv. 26: 22–34. [RPJMD] Kabupaten Lumajang. 2009. Rencana Pembangunan Jangka Kabupaten Menengah Daerah Kabupaten Lumajang 2010 - 2014. Sambrook J, Russel DW. 2008. Molecular Cloning a Laboratory Manual, Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, p.999 Stern NJ, Svetoch EA, Eruslanov BV, Perelygin VV, Mitsevich EV, Mitsevich IP, Pokhilenko VD, Levchuk VP, Svetoch OE, Seal BS. 2006. Isolation of a Lactobacillus salivarius strain and purification of its bacteriocin, which is inhibitory to Campylobacter jejuni in the chicken gastrointestinal system. J Antimicrobial Agents and Chemotherapy . 50 9 :3111–3116 67 Suharsono, Widyastuti U. 2008. Penuntun Praktikum; Pengantar Genetika Molekuler. Departemen Biologi-FMIPA. Institut Pertanian Bogor Sujaya N, Ramona Y, Widarini NP, Suariani NP, Dwipayanti NMU, Nociaanitri KA, Nursini NW. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari susu kuda sumbawa. J Veteriner. 9 2: 52-59 Tamang B, Tamang JP, Schillinger U, Franz CMAP, Gores M, Holzapfel WH. 2008. Phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria isolated from ethnic fermented bamboo tender shoots of North East India. Int J Food Microbiol . 121: 35–40 Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1995. CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, Position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acid Res . 22: 4673-4680 Vela AI, Porrero C, Goyache J, Nieto A, Sánchez B, Briones V, Moreno MA, Domínguez L, Garayzábal JFF. 2003. Weissella confuse Infection in Primate Cercopithecus mona. J Emerging Infectious Diseases. 9 10 Ward DM. 1998. A natural species concepts for procaryotes. Current Opinion in Microbiol . 1: 271-277 68 69

6. PENINGKATAN PATI RESISTEN TEPUNG PISANG MELALUI FERMENTASI OLEH