3 METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2012 hingga Juli 2012. Penelitian ini diawali dengan pengambilan sampel yang dilakukan di persawahan
daerah Cilegon, Banten. Tahap berikutnya yaitu preparasi sampel yang dilakukan di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Departemen Teknologi
Hasil Perairan IPB. Analisis sampel yang meliputi berbagai uji dilakukan di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan dan Mikrobiologi Hasil Perairan Teknologi
Hasil Perairan Institut Pertanian Bogor.
3.2 Alat dan Bahan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah tumbuhan semanggi air M. crenata. Pelarut yang digunakan adalah pelarut pro analisis
berupa heksana nonpolar, etil asetat semi polar, dan metanol polar. Bahan lain yang digunakan antara lain alumunium foil, kertas saring Whatman 42,
alkohol, akuades, kertas cakram paper disc Whatman, media Nutrient agar NA, Nutrient Broth NB,
Mueller Hinton Agar MHA, serta antibiotik kloramfenikol, biakan bakteri Bacillus subtilis dan Escherichia coli.
Alat yang digunakan seperti timbangan digital AND HF-400, gelas piala, gelas ukur, botol vial, labu ukur, corong, labu Erlenmeyer, automatic shaker,
mikropipet, tip mikro, cawan petri, tabung reaksi, pipet volumetrik, vortex Velp Scientifica, kompor listrik, water shaker bath, pinset, laminar Thermo 1300 seri
A2, pipet tetes, incubator Thermolyne type 42000, dan jangka sorong.
3.3 Metode penelitian
Penelitian ini terdiri dari empat tahap, yaitu tahap pengambilan dan preparasi sampel, ekstraksi komponen bioaktif, uji fitokimia, dan analisis aktivitas
antibakteri. Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9 Diagram alir penelitian.
Sampel daun semanggi air
Pengeringan udarakan sampel daun selama 17 jam Sampel daun
kering udara Pencacahan
Penambahan heksana 1:5 bv
Penambahan metanol 1:5
bv Maserasi selama 24
jam hingga bening Penyaringan dengan kertas Whatman 42
Filtrat Residu
Penyaringan dengan kertas Whatman 42 Penambahan
etil asetat 1:5 bv
Residu
Filtrat Residu
Penyaringan dengan kertas Whatman 42 Maserasi selama 24
jam hingga bening
Maserasi selama 24 jam hingga bening
Evaporasi Filtrat
Gambar 9 Diagram alir penelitian lanjutan.
3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel
Marsilea crenata merupakan tanaman air yang tumbuh liar di daerah sekitar persawahan. Semanggi air ini diambil bagian daunnya. Preparasi
M. crenata ini pertama dicuci dengan air mengalir, kemudian daunnya dihaluskan dengan cara pencacahan. Daun yang telah dihaluskan kemudian dikering-
udarakan selama 17 jam. Daun yang sudah kering ditimbang sebanyak 20 gram.
3.3.2 Ekstraksi komponen bioaktif Andayani 2008
Ekstraksi bahan aktif dilakukan dengan mengacu pada penelitian Andayani 2008 yang dimodifikasi. Proses ini menggunakan tiga jenis pelarut
ekstraksi bertingkat yaitu heksana nonpolar, etil asetat semipolar, dan metanol polar. Semanggi air yang telah dikeringkan dan dihaluskan kemudian
ditimbang sebanyak 20 gram lalu dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan ditambahkan 100 mL pelarut 1:5. Sampel dimaserasi selama 24 jam
menggunakan automatic shaker pada suhu kamar. Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman 42 sehingga diperoleh filtrat dan residu.
Residu sampel dimaserasi kembali dengan pelarut yang sama hingga bening atau sama dengan warna pelarut awal, kemudian diganti dengan pelarut lain secara
bertingkat nonpolar, semipolar dan polar. Proses maserasi yang dilakukan diawali dari pelarut heksana, etil asetat, dan metanol. Filtrat yang diperoleh
kemudian dikeringkan dengan vacuum rotary evaporator pada suhu 40 °C hingga diperoleh ekstrak kasar berupa pasta.
Ekstrak kasar heksana
Ekstrak kasar etil asetat
Ekstrak kasar metanol
Analisis: •
Rendemen •
Uji fitokimia Harborne 1987 •
Uji aktivitas antibakteri
3.3.3 Uji fitokimia Harborne 1987
Uji fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid, steroidtriterpenoid, flavonoid, saponin, dan fenol hidrokuinon. Uji ini dilakukan untuk mengetahui
keberadaan komponen bioaktif yang terdapat pada M. crenata.
1 Alkaloid
Uji alkaloid dilakukan dengan melarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi
Dragendorff, pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji positif diperoleh bila terbentuk endapan putih kekuningan dengan pereaksi Meyer, endapan coklat
dengan pereaksi Wagner atau endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff sehingga jika pengujian terhadap salah satu pereaksi positif, maka
dalam tumbuhan uji tersebut terdeteksi alkaloid. Pereaksi Meyer dibuat dengan menambahkan 1,36 HgCl
2
dengan 0,5 g KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 mL dengan labu
takar. Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi Wagner berwarna coklat dibuat dengan cara 10 mL akuades dipipet kemudian ditambahkan 2,5 gram iodin dan 2
gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 mL dalam labu takar. Pereaksi Dragendorff berwarna jingga dibuat dengan cara 0,8 g bismut
subnitrat ditambahkan dengan 10 mL asam asetat dan 40 mL air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 gram KI dalam 20 mL air. Sebelum
digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume campuran 20 mL asam asetat glasial dan 100 mL air.
2 Triterpenoidsteroid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 mL kloroform dalam tabung reaksi yang kering lalu ditambahkan 10 tetes anhidra asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat.
Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau.
3 Saponin uji busa
Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan
adanya saponin.
4 Fenol Hidrokuinon
Sebanyak 1 gram sampel diekstrak dengan 20 mL etanol 70. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 mL kemudian ditambahkan 2 tetes larutan
FeCl
3
5. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau hijau biru.
5 Flavonoid
Sebanyak 0,5 mg sampel ditambahkan serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 mL amil alkohol campuran asam klorida 37 dan etanol 95 dengan volume
yang sama dan 4 mL alkohol kemudian campuran dikocok. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan
amil alkohol.
6 Tanin
Sebanyak 0,5 mg sampel ditambahkan FeCl
3
kemudian campuran dihomogenkan. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah
pada campuran.
7 Uji Molisch
Larutan sampel sebanyak 1 ml diberi 2 tetes pereaksi Molisch dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Uji positif yang menunjukkan adanya
karbohidrat ditandai dengan terbentuknya kompleks warna ungu diantara 2 lapisan cairan.
8
Benedict
Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 mL pereaksi Benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Hasil uji positif
sampel mengandung gula pereduksi yaitu terbentuknya larutan berwarna hijau kuning atau endapan merah bata.
9 Biuret
Larutan sampel sebanyak 1 mL ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 4 mL. Campuran kemudian dikocok dengan seksama. Hasil uji senyawa peptida
dengan terbentuknya larutan berwarna ungu.
3.3.4 Analisis aktivitas antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak kasar daun semanggi air melalui beberapa tahap, yaitu persiapan bakteri melalui peremajaan bakteri dan
kultivasi bakteri uji. Kondisi kultur bakteri yang telah disiapkan sebagai bakteri uji kemudian dilakukan pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode
difusi kertas cakram paper disc.
Peremajaan bakteri uji
Media yang digunakan adalah NA dengan komposisi: ekstrak daging 1, pepton 1, dan agar 1,5. Media dilarutkan dalam akuades dan dipanaskan
hingga larut sempurna, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 4 mL dan disterilkan dalam otoklaf pada suhu 121 °C, tekanan 1 atm selama 15 menit.
Setelah steril, tabung dimiringkan dan didiamkan hingga memadat. Sebanyak 1 ose stok bakteri B. subtilis dan E. coli diinokulasi ke dalam media regenerasi
kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam.
Kultivasi bakteri uji
Bakteri Bacillus subtilis dan E. coli yang segar diinokulasikan sebanyak 1 ose ke dalam media NB, diinkubasi semalam pada suhu 37 °C dengan kecepatan
putaran 150 rpm selama 18-24 jam. Kultur bakteri diukur kekeruhannya secara turbidimetri menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang
600 nm hingga mencapai OD sebesar 0,6.
Pengujian aktivitas senyawa antibakteri ekstrak kasar semanggi air terhadap bakteri uji Modifikasi Murray et al. 1995
Pengujian dilakukan dengan metode cakram kertas paper disc. Sampel antibakteri merupakan senyawa aktif hasil proses ekstraksi semanggi air. Proses
pengujiannya adalah sebagai berikut: bakteri B. subtillis dan E. coli yang telah diinokulasi ke dalam media pertumbuhan NB, masing-masing dimasukkan ke
dalam media MHA steril. Media MHA yang mengandung bakteri uji dihomogenisasi menggunakan
vortex kemudian dituang pada cawan petri steril secara aseptis. Konsentrasi ekstrak kasar yang dimasukkan ke dalam cakram kertas paper disc, yaitu 2 mg,
1 mg, dan 0,5 mg, serta kontrol positif dan negatif. Perlakuan kontrol positif yaitu menggunakan antibiotik kloramfenikol dengan konsentrasi 10 mgmL. Kontrol
negatif menggunakan pelarut dalam proses ekstraksi yaitu heksana, etil asetat, dan metanol. Kertas cakram kemudian diletakkan diatas lapisan MHA di dalam cawan
petri yang telah mengeras. Cawan petri diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam dan dilakukan pengukuran aktivitas antibakteri yang ditentukan dengan mengukur
zona hambatan dalam milimeter yang terbentuk di sekeliling kertas cakram dikurangi dengan diameter kertas cakram 6 mm.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pemanenan dan Preparasi Semanggi Air M. crenata
Semanggi air merupakan tumbuhan air yang banyak terdapat di lingkungan air tawar seperti, sawah, kolam, danau, dan sungai. Semanggi air
sering dianggap sebagai gulma pada tanaman padi namun memiliki nilai kegunaan yang beraneka ragam Afriastini 2003. Pengambilan sampel dilakukan di
persawahan daerah Cilegon, Banten. Semanggi air yang diperoleh kemudian diperbanyak kembali menggunakan media pot yang dibuat menggunakan papan
triplex dan kayu dengan ukuran 1,8 m
2
.
Gambar 10 Media pertumbuhan semanggi air Marsilea crenata. Penanaman semanggi air ini dilaksanakan selama ±3 minggu kemudian
diambil bagian daunnya dan dikering udarakan selama 17 jam. Bobot sampel yang digunakan dalam penelitian ini sebesar 40 gram untuk dua kali ulangan.
Sampel ini akan digunakan dalam ekstraksi komponen bioaktif menggunakan metode maserasi.
4.2 Rendemen Ekstrak Semanggi Air M. crenata
Ekstraksi semanggi air dilakukan dengan metode maserasi. Semanggi air yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari daerah persawahan di Cilegon,
Banten. Ekstraksi komponen bioaktif pada semanggi air menggunakan metode maserasi dengan tiga pelarut yang berbeda kepolarannya ekstraksi bertingkat,
yaitu heksana p.a non polar, etil asetat p.a semi polar, dan metanol p.a polar. Maserasi merupakan ekstraksi sederhana yang dilakukan dengan cara merendam
sampel dalam suatu pelarut selama beberapa hari pada temperatur kamar dan
terlindung dari cahaya Sudjadi 1986. Andayani 2008 menyatakan bahwa metode maserasi memiliki beberapa keunggulan, yaitu mudah dilakukan dan bisa
menggunakan alat-alat yang sederhana. Proses evaporasi dari filtrat semanggi air dengan ketiga jenis pelarut
menghasilkan karakteristik yang berbeda-beda. Ekstrak heksana berwarna kuning dan kering, ekstrak etil asetat berwarna hijau tua dan masih berbentuk pasta,
sedangkan ekstrak metanol memiliki warna hijau lebih muda daripada ekstrak etil asetat dan berbentuk pasta namun lebih kering dari ekstrak etil asetat. Hasil
ekstrak kasar semanggi air dapat dilihat pada Gambar 11.
Gambar 11 Ekstrak kasar semanggi air. a ekstrak metanol, b ekstrak heksana, c ekstrak etil asetat.
Menurut Parhusip 2006, rendemen ekstrak merupakan faktor yang sangat penting karena menunjukkan banyaknya senyawa organik yang larut dalam
pelarut tersebut sesuai dengan polaritasnya. Ekstraksi dengan tiga pelarut yang berbeda-beda akan memperoleh rendemen ekstrak kasar yang berbeda-beda pula.
Rendemen ekstrak merupakan perbandingan antar bobot ekstrak yang dihasilkan dengan bobot sampel awal yang diekstrak. Rendemen ekstrak dinyatakan dalam
persen . Ekstraksi daun semanggi air dilakukan dengan dua ulangan dan nilai rata-rata rendemen ekstrak dari masing-masing pelarut dapat dilihat pada diagram
batang Gambar 12. Proses perhitungan rendemen ekstrak disajikan dalam Lampiran 1.
Berdasarkan Gambar 12 dapat diketahui bahwa rendemen ekstrak kasar terbesar sampai terkecil berturut-turut, yaitu rendemen ekstrak kasar semanggi air
✁
c
dari pelarut metanol sebesar 1,39±0,08, dari pelarut etil asetat sebesar 1,03±0,5, dan rendemen ekstrak kasar semanggi air dari pelarut heksana sebesar
0,27 ±0,3. Nilai rata – rata rendemen ekstrak kasar memiliki standard deviasi
yang kecil. Nilai standard deviasi yang didapatkan menunjukan keragaman data yang diperoleh. Nilai standard deviasi rendemen ekstrak kasar metanol lebih kecil
dibandingkan etil asetat dan heksana. Data rendemen ekstrak kasar metanol tidak berbeda jauh tiap ulangannya, sedangkan rendemen ekstrak kasar etil asetat dan
heksana memiliki perbedaan data yang lebuh banyak pada tiap ulangannya. Perbedaan rendemen ekstrak kasar tiap ulangannya disebabkan oleh perbedaan
perlakuan antara ulangan pertama dan ulangan kedua.
Gambar 12 Rendemen ekstrak kasar semanggi air Marsilea crenata. Rendemen terbesar diperoleh dari ekstraksi dengan pelarut metanol.
Menurut Kasih 2007, rendemen ekstrak etanol polar pada biji lotus lebih besar karena ekstrak mengandung gula, asam amino dan glikosida dalam jumlah yang
cukup besar, hal ini didukung dengan hasil penelitan Kristiono 2009 bahwa semanggi air mengandung protein yang cukup tinggi yaitu sebesar 4,35.
Menurut Nurhayati 2009, pelarut metanol diketahui dapat menarik semua komponen baik yang bersifat polar, semipolar maupun nonpolar. Metanol sebagai
1,6
0,6 1,2
1,4
0,4 1,0
0,2 0,8
metanol etil asetat
heksana
pelarut yang digunakan paling akhir pada proses ekstraksi diduga menarik semua komponen aktif yang tertinggal pada ekstraksi sebelumnya sehingga rendemen
ekstrak metanol cukup besar. Rendemen terkecil diperoleh dari ekstraksi dengan pelarut nonpolar
heksana yaitu sebesar 0,27. Hal ini disebabkan oleh kandungan lemak dalam semanggi air yang sangat kecil, seperti pada penelitian Kristiono 2009 yang
menyatakan bahwa kadar lemak dalam semanggi air segar sebesar 0,27 yang lebih kecil dari kandungan lemak tumbuhan kangkung sebesar 0,3. Menurut
Parhusip 2006, tingginya rendemen ekstrak nonpolar menunjukkan bahwa komponen yang dapat larut dalam heksana sangat banyak, begitupun sebaliknya.
Rendemen ekstrak etil asetat daun semanggi air sebanyak 1,03. Etil asetat merupakan senyawa semi polar yang dapat melarutkan senyawa organik yang
bersifat polar maupun non polar sehingga memiliki rendemen yang cukup tinggi dibandingkan ekstrak non polar semanggi air.
Hasil ekstrak yang diperoleh akan sangat tergantung pada beberapa faktor, yaitu kondisi alamiah senyawa tersebut, metode ekstraksi yang digunakan, ukuran
partikel sampel, kondisi dan waktu penyimpanan, lama waktu ekstraksi, serta perbandingan jumlah pelarut terhadap jumlah sampel Harborne 1987;
Darusman et al. 1995. Hasil penelitian Salamah 2008 menunjukkan bahwa maserasi dengan jenis pelarut yang berbeda akan menghasilkan rendemen ekstrak
yang berbeda pula. Pernyataan tersebut mendukung penelitian ini,bahwa kadar komponen bioaktif yang bersifat polar, semipolar, dan nonpolar terdapat dalam
jumlah yang berbeda-beda. Pelarut yang berbeda akan melarutkan senyawa- senyawa yang berbeda bergantung tingkat kepolarannya dan tingkat
ketersediaannya dalam bahan yang diekstrak.
4.3 Senyawa Fitokimia Semanggi Air M. crenata