3.2.2. Ekstraksi DNA
DNA diekstraksi dari sirip dan sel gonad menggunakan 200 μL Cell Lysis Solution
Gentra, Minneapolis, USA dan 1,5 μL Proteinase K 20 mgmL. Inkubasi dilakukan pada suhu 55°C selama semalam. Setelah sel terlisis
sempurna, ditambahkan 1,5 μL RNase 4 mgmL dan diinkubasi 37
o
C selama 60 menit. Kemudian ke dalam tabung sampel ditambahkan 100 μL Protein
Precipitation Solution Gentra, Minneapolis, USA, disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam
mikrotub yang berisikan 300 μL isopropanol. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, kemudian
ditambahkan 300 μL etanol 70 dingin ke dalam mikrotub berisi pellet DNA. Sampel disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan dibuang, pellet DNA dikeringudarakan dan ditambahkan 30 μL Sterille Destillate WaterSDW. DNA disimpan dalam freezer suhu -20
o
C hingga akan digunakan.
Analisa kemurnian dan kandungan DNA dilakukan melalui dua cara yaitu secara kuantitatif dengan spektrofotometer GeneQuant
dan kualitatif menggunakan elektroforesis. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 260
λ
260
nm. Kemurnian DNA diketahui dengan melihat rasio DNA pada perbandingan absorbansi panjang gelombang 260 nm dengan panjang gelombang
280 nm. Kandungan DNA ditentukan dari pengukuran pada λ
260
.
3.2.3 Amplifikasi DNA dengan PCR
Total volume untuk pereaksi PCR yaitu 10 µL, mengandung 1 µL 10x Ex Taq buffer; 1 µL dNTPs mix; 0,05 µL Ex Taq polimerase Takara Bio, Shiga,
Japan; 1 µL DNA templet; dan 1 µL masing-masing primer forward dan reverse; sisanya adalah SDW. Pengecekan hasil amplifikasi PCR dilakukan dengan
elektroforesis menggunakan gel agarosa 1. Program PCR disesuaikan dengan suhu lebur primer yang digunakan terutama pada proses annealing dan lama
waktu ekstensi. Primer yang digunakan adalah GH, β-aktin, dan vasa. Suhu
annealing dan lama waktu ekstensi untuk primer GH dan β-aktin masing-masing
adalah 58
o
C dan 45 detik untuk primer GH; 63
o
C dan 30 detik untuk primer β-
Kategori